哪里?
20．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应 注意哪些问题?
21．假定你分离到一个E．coli的Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计 一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli 野生型的ThyA基因的序列是已知的)
22． 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤 是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步， 直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自 显影片是空白。错在哪里?
23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
24．用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆 中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。 25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?
26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列， 并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基
酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用 DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets 受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA 而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子? 答案 1． 答：
Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的 作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延 伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末 端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获 得4组长度不同的DN***段。通过比较所有DN***段的长度可以得知核苷酸的 序列。 2． 答：
盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。 3． 答：
回文序列是：5'-CATATG-3， 4． 答：
GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。 5．答：
注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一 种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。 6． 答：
由于反转录酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。 7． 答：
所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，
这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'---3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，测序时常用此酶。 8． 答：
S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。 9. 答：
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。 10．答：
(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。 11．答：
含有细菌质粒和克隆的真核生物DN***段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。 12. 答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记； (4)引入终止突变 13．答：
(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 14．答：
基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。 15．答：
化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DN***段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。 16．答：
(1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用COS位点包装l噬菌体颗粒； (3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。 17．答：
(1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。 18．答：
(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。 19．答：
PCR用双引物，体内复制用单引物。 20．答：
应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。 21．答：
为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5’端相同，另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。 22．答：
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结
果。 23．答：
(1)DNaseI造成切口；
(2)DNA聚合酶III的5’ ?3’外切核酸酶进行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶进行修补；
(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。 24．答：
原因是：HindⅢ的切点在A基因内。 25．答：
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。 26．答：
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。 27．答：
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
四、问答题：
1． 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
2． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向? 3． 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用? 8．质粒如何维持在细胞中的稳定？
9．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行 严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几 个方面?
10．为什么野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体? 11． 什么是蓝白斑筛选法?
12． 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 13． M13系列载体具有哪些优缺点? 14．黏粒载体具有哪些特点与不足?
15．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?
16． 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法 克隆该基因?
17． 什么是基因文库?
18． 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗 传学上的基因库有什么不同?
19． 什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?
20． 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出 这些不足之处。
21．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点?
22．何谓接头连接法(1inker ligation)?
23．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?
24．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单 体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
25．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培 养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片 段的重组体?
26． 以pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨 酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。
27． 放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么? 28． 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA? 29．什么是印迹(blotting)杂交?
30．什么是原位菌落杂交(colony hybridization)? 31．说明Southern杂交的原理和方法。 32．Northern印迹与Southern印迹有什么不同?
33．建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆? 答案： 1． 答：
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；
(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，
但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正体。 2． 答：
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限 制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 3． 答：
影响DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以12°C一15°C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。
有非Mg2+的二价阳离子存在(如