T-DNA正向插入到基因组中情况：

T-DNA反向插入到基因组中情况：

第四步，确定引物组合

根据第三步的结论，我们可以选择引物组合进行基因型鉴定（见表二）。 表二： 分离侧翼序列的引物 NTLB5 PFRB4 T-DNA正向插入 S+AS/S+NTLB5 S+AS/AS+PFRB4 T-DNA反向插入 S+AS/AS+NTLB5 S+AS/S+PFRB4 4.3 举例说明

鉴定基因型的步骤：

1）用突变体的侧翼序列（可在http://rmd.ncpgr.cn/查找）和水稻基因组比对（推荐NCBI），找到T-DNA插入位点。以03Z11AA66为例，其侧翼序列为： >Sequence1|Possible location: Chromosome 3 (by Zhang Jian) CGTCCGCAATGTACTCACCCGGCCTAGCA TACGACCTGCTGCCTGTCTTGAGAACGCC ACGAAGCGGCAGCCTGCATGTCGTTTACG AGGAGCCCTTAGATTCCCCTCCAGAATTA GGAGTACACGCCCTGTGTTGGTGTCGATC AATCGATAATGTAGATTGATCGCAATCGA GATGGGTGTTGATGAGCAGGATCATATCC ATCCTCCTCTTGGGGGTTTCTCTGCAGGC TCCTGACAGACAATGAATGTGTGCACATG ATCAATGCAGATGCGTGCAGCTATCGAAA TCTTGGTTGGTACTTGTCCTGGATGGCTT GATTAGATTGTTAATACCAAAACACATTT TTTCGCTCATACTGATATACGAGTAGTAG TAGGACTTCCTCGTGAGCTCTCTTGAATT CATCTCACTCGACGA

用该侧翼序列在NCBI上做BLAST， 结果如右图：

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由BLAST结果可知以下信息：

1.T-DNA插入为点为第三染色体5013391处， 2.该家系strand=Plus/ Plus，

3.分离侧翼序列的引物为NTLB5（TTL _03Z11AA66 _NTLB5） 将2和3结果对应表一得知T-DNA是反向插入在基因组中。

2） 在插入位点（5013391）处，取前后1Kb的序列如下：（红色为引物潜在区）

1 agcccaaccc gaccctgccc cgcctcgttg ccatccctag ctgcaacctc gggtgcccca 61 ccagcgagca tgggcaattc cgtctcatca cccggtattc caacgaaaaa gatttcaaaa 121 atgcacaaaa cgatcgaaat ggcaaagtga ctgtgagtac gcgcttcata ttgacatttt 181 aacgaagcgt gtttttgaga tggcattcca atgatactgt tttttaaacc tggtcaaatg 241 tccattttct agttcgggac ttcccagtcc tagccatgta gcctgagagc tgagatacac 301 accccagcag tatcctgtgc aaggcatgat cgagtcgaat ccgtccctgc caatggcaca 361 agtcttttca agggggtgtt tagcccctct cccccccccc ccccccctag ctagctggta 421 gtggctggcg ctacgcatgc acaggcacgt cgcttcgccc gctgcgtgca tcatatgcat 481 ccatccatct ggtctcctgt tttatggacg gacgggtcgc tgcacgggcg gtctgcacgc 541 tgtcacgcgc agcctggcat acgggcttgt catatgtcaa agatgcagac acacacgaca 601 caagagccag ttggggttgg gaggttgcgc gtagcctctt tcccacacgt gaccccctcc 661 ctactctccc cactgccgcc acaacttacc aggatccatg cgagaatcgc accaaaaacg 721 ccaccaatct cgtgaactcc accacctcca tcgtatcgcc cggcctttcc actagctagc 781 agcctagcac acagctgatc gatcggcgaa gctagtcacg ccacggcgat gcgattatcc 841 cggtgtcgtt tacgcggcgg ccgctagggt gtcggatggg ctatgtcgtc gtcgttgcca 901 ctgcttgtgt gtgtaccaaa tcgggtgcgt tgtttcgact gttggtcgat gcgagtacct 961 accgcatgtg atggacgggc ctgcaggcga cttgtcgatg gcaacgtact cacccggcct 1021 agcatacgac ctgctgcctg tctcgtgaac gccacgaagc ggcagcctgc atgtcgttta 1081 cgaggagccc ttagattccc ctccagaatt aggagtacac gccctgtgtt ggtgtcgatc 1141 aatcgataat gtagattgat cgcaatcgag atgggtgttg atgagcagga tcatatccat 1201 cctcctcttg ggggtttctc tgcaggctcc tgacagacaa tgaatgtgtg cacatgatca 1261 atgcagatgc gtgcagctat cgaaatcttg gttggtactt gtcctggatg gcttgattag 1321 attgttaata ccaaaacaca ttttttcgct catactgata tacgagtagt agtaggactt 1381 cctcgtgagc tctcttgaat tcatgtgtgt cggagcggca gcgtcacacg ctgcgcccct 1441 acgcattttt aggatctcag agcagtcatc agtcttcgtg tacctcagta ctttgaattc 1501 tctttgcctg tagcagatgc tttttttttt tgacatgaat agcagatgca ttcactgtgc 1561 attcccttcc cccttctctc gatcgacgcg acttacccgt atactgcatc actgcaaact 1621 cacataaatt tacccgtgac cgtgtgcccg tgtgatcatc ctccaatcaa actgtccttc 1681 ccttttcacc ttaaaaggac cggccggaac gcttctctca tcttccagtc gtactattac 1741 agtccagtcg ccgcaatgga tggctggcat gtcaaagatg atgaattggt gatggtggca 1801 cccggttgca cttgcgcccg cggctggcaa cgcggcatca cagatctcac acgcgcggac 1861 taaaaaccga cgtgacaaca cggccgcggc caacgacgag accggccggt atgggagctt 1921 gccgctgcat gcgacgtcga cgttgatgtg gccaagacac ggagcgttac gtatagtgcg 1981 ctcgtacgca ggcgcgcatg c

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针对这段序列设计两条引物（下图中AS，S），产物大小在800至1200bp之间（建议在1Kb左右），插入位点在产物中间位置（距离产物两端400－600bp均可）。

对于03Z11AA66家系而言，则应该选择引物组合为：S+AS/AS+NTLB5或者S+AS/S+PFRB4，由于我们分离出的是左端序列，您一般用NTLB5来验证杂合、纯合，即选用组合S+AS/AS+NTLB5。当然也可以选择S+AS/S+PFRB4组合，特别是第一个组合扩增不出来的时候。

3） 使用引物检测基因型（条带位置根据你的引物而定）

W：野生型，H：杂和型，M：纯和型

附注：对于Tos17反转录转座子的突变体，检测原理与T-DNA 插入突变体基因型检测原理步骤是一致的，引物选择如下表： 分离侧翼序列的引物 Tos17 正向 TOSLS S+AS/S+TOSLS TOSRS S+AS/AS+TOSRS 本文撰写主要参考：

吴昌银．水稻T-DNA 插入突变体库及其Enhancer trap系的创建．[博士学位论文]．武汉：华中农业大学图书馆，2003

Tos17 反向 S+AS/AS+TOSLS S+AS/S+TOSRS

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附录1

诱导和继代：

N6max+N6min+2, 4-D (2.5 mg/L)+Vitamin+Fe2+-EDTA+CH 0.6g+0.3% Phytagel+3% Sucrose, pH6.0

预培养和共培养：

1/2 N6max+1/2 N6min+2,4-D (2 mg/L)+Vitamin+Fe2+-EDTA+CH 0.6g+0.8% Agarose+2% Sucrose+1% Glucose+200 μM AS, pH5.6

农杆菌悬浮培养液：

1/2 N6max+1/2 N6min+2,4-D (2 mg/L) +Vitamin+Fe2+-EDTA+CH 0.6g+2% Sucrose+1% Glucose

+200μM AS， pH5.2

抗性愈伤筛选：

N6max+N6min+2, 4-D (2.5 mg/L)+Vitamin+Fe2+-EDTA+Pro 0.3g+0.8% Agarose +3% Sucrose +400 mg/L Cef+50 mg/L Hn, pH6.0

分化：

MSmax+MSmin+Fe2+-EDTA+Vitamin+2% Sucrose+CH 0.6g+BA (2 mg/L)+KT (2 mg/L)+IAA (0.2 mg/L)+NAA (0.2 mg/L)+0.3% Phytagel, pH6.0

生根：

1/2 MSmax+MSmin+Fe2+-EDTA+Vitamin+2% Sucrose+CH 0.6g+0.3% Phytagel, pH5.8

CH-水解酪蛋白，AS-乙酰丁香酮，Hn-潮霉素，Cef-头孢霉素，KT-激动素，BA-苄基腺嘌 呤，Pro-脯氨酸，IAA-吲哚-3-乙酸，NAA-萘乙酸。 附录2

组培操作：

1 将种子去除颖壳，挑选质量好的米粒。

2 75%乙醇漂洗1min，漂洗过程中需要不断振荡。 3 1.5‰HgCl2漂洗18min，大约每隔3min振荡一次。

4 用灭过菌并放凉的ddH2O漂洗3~5次，去除表面残留的HgCl2。

5 将处理好的种子放入生根培养基上，于光培养室培养，约半个月后可长成完整植株，再移入田间。 生根培养基：

MSmax母液(10×) 50ml MSmin母液(100×) 5ml Fe2-EDTA母液 (100×) 10ml Vitamin母液 (100×) 10ml 蔗糖 20g Phytagel 3g

加H2O 1000ml并用1N KOH调节pH到5.8，煮开后分装到生根管中，封口膜封口灭菌。 培养基配方： 1. MSmax(10×)

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