实验一：食品中亚硝酸盐的测定

一、实验目的

1. 掌握盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐的原理 2. 掌握分光光度计的使用、标准曲线的绘制及计算方法 3. 了解分光光度计的构造 二、实验原理

样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为538 nm，可测定吸光度并与标准比较定量。 三、仪器与试剂 1. 仪器

（1）分光光度计 （2）小型胶肉机 （3）恒温水浴锅 2．试剂

（1）亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。 （2）乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0 g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000 mL。

（3）饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。 （4）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4ｇ对氨基苯磺酸，溶于100mL20 %（V/V）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

（5）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中, 混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000ｇ于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（7）亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 四、实验步骤 1. 提取

称取2.50g经绞碎混匀的样品，于50mL烧杯中，加硼砂饱和溶液12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300 mL 将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。 2. 提取液净化

在振荡上述提取液时加入5 mL 亚铁氰化钾溶液, 摇匀, 再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度, 摇匀, 放置30min, 除去上层脂肪, 上清液用滤纸过滤, 弃去初滤液30mL，滤液备用。

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3. 亚硝酸盐的测定与数据记录 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 标准使用液体积mL 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.50 2.00 样品质量 g 样品提取液体积mL 对氨基苯磺酸溶液 盐酸萘乙二胺溶液 水 比色测吸光度 吸光度 / / 2mL(混匀,静置3-5min) 1mL 至刻度，混匀，静置15min 2cm比色皿，538nm，0管调零 五、结果计算 1. 绘制标准曲线

以亚硝酸钠量（μg）为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2. 用样品提取液的吸光度，在以上亚硝酸钠标准曲线上查出亚硝酸钠的量(μg)。 3. 计算

m’×1000

X= ————————— V2

m × ——×1000 V1

式中：X——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg；

m’——测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg； m——样品的质量，g V1——样液总体积mL

V2——测定用样液体积mL 六. 思考题

1. 若从标准曲线上查不到滤液所相当的亚硝酸钠量（即大于10μg）是，如何改进本实验？

2. 采用回归方程计算与从校正曲线直接求得亚硝酸钠的含量，各有什么优缺点？

3. 紫外可见分光光度计由哪几部分组成，每个主要部分的作用是什么？ 4. 使用紫外可见分光光度计时，应注意哪些问题？

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实验二：茶饮料中茶多酚的测定

一、实验目的

1. 掌握分光光度计法测定茶饮料中茶多酚的基本原理和操作程序。 2．掌握分光光度计的使用及计算方法 二、实验原理

茶饮料中的多酚类物质能与亚铁离于形成紫蓝色络合物，用分光光度计法测定其含量。

三、仪器与试剂 1. 仪器

（1）分析天平：感量0.001g。 （2）分光光度计。 2. 试剂

所用试剂均为分析纯(AR)；试验用水应符合GB/T 6682中的三级水规格。 （1） 酒石酸亚铁溶液：称取硫酸亚铁0.1g和酒石酸钾钠0.5g，用水溶解并定容至100mL(低温保存有效期10天)。 （2）pH7.5磷酸缓冲溶液

A. 23.87 g/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠23.87 g加水溶解后定容至1 L。

B. 9.08g/L磷酸二氢钾：称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述磷酸氢二钠溶液85mL和磷酸二氢钾溶液15mL混合均匀。 四、实验步骤 1. 试液制备

（1）含二氧化碳茶饮料

量取充分混匀的样液100mL于250mL烧杯中，称取其总质量，然后置于电炉上加热至沸，在微沸状态下加热10min，将二氧化碳气排除。冷却后，用水补足其原来的质量。摇匀后，备用。 （2）茶叶

称取3g磨碎样品于500mL锥形瓶中，加入热蒸馏水450mL,立即移入沸水浴中浸提45min（每隔10min摇动一次）浸提完毕后，立即趁热减压过滤。滤液移入500mL容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2-3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后，用蒸馏水稀释至刻度。 2. 测定 （1）茶饮料

精确移取上述制备的试液1 mL～5 mL于25 mL容量瓶中，加水4 mL、酒石酸亚铁溶液5mL，充分摇匀，用pH7.5磷酸缓冲溶液定容至刻度。用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白作参比，测定其吸光度(A1)。同时移取等量的试液于25mL容量瓶中，加水4mL，用pH7.5的磷酸缓冲液定容至刻度，测定其吸光度(A2)。 （2）茶叶

精确移取上述制备的试液1 mL于25 mL容量瓶中，加水4 mL、酒石酸亚铁溶液5mL，充分摇匀，用pH7.5磷酸缓冲溶液定容至刻度。用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白作参比，测定其吸光度(A)。

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五、结果计算 1. 数据记录 （1）茶饮料 样品质量m g 测定用样液体积 mL 试液显色后的吸光度A1 试液底色的吸光度A2 （2）茶叶 样品质量M g 试液显色后的吸光度A 2. 计算

(1)茶饮料中茶多酚含量计算公式

(A1- A2)×1.957×2×K

X= ———————————×1000 m

式中： X——样品中茶多酚的含量，mg/kg;

A1——试液显色后的吸光度；

A2——试液底色的吸光度； K——稀释倍数；

m ——测定时称取试样的质量，g；

1.957——用10mm比色皿，当吸光度等于0.50时，1mL茶汤中茶多酚的含量相当于1.957mg。

（2）茶叶中茶多酚含量计算公式

A×1.957×2 V1

X(%)= ————————×————×100 100 V2×M

X——样品中茶多酚的含量，% A——试样溶液的吸光度；

M——称取试样的质量，g

V1——试样溶液的总体积，mL V2——测定用试样溶液的体积，mL

1.957——用10mm比色皿，当吸光度等于0.50时，1mL茶汤中茶多酚的含量相当于1.957mg。 六. 思考题

1. 若实验室无10mm比色皿，可否用1mm比色皿进行测定，若可以，结果计算公式将作何变化。

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实验三：火焰原子吸收光谱法测定食品中的铜

一、实验目的

1. 通过对铜最佳测定条件的选择，了解与火焰性质有关的一些条件参数对铜测定灵敏度的影响；

2. 了解原子吸收分光光度计的基本结构和原理；

3. 掌握火焰原子吸收光谱分析的基本操作；学习食品中铜含量的测定方法。 4. 熟悉和掌握原子吸收分光光度法的定量分析方法 5. 学习微波消解仪在样品前处理中的应用 二、实验原理

样品处理后，导入原子吸收分光光度计中，原子化以后，吸收324.8共振线，其吸收量与铜含量成正比，与标准系列比较定量。 三、仪器与试剂 1. 仪器

（1）原子吸收分光光度计（附铜空心阴极灯）

（2）微波消解仪 2. 试剂

除非另有规定，本方法所使用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。 （1） 硝酸：优级纯 （2） 过氧化氢（30%） （3） 硝酸：1+99

（4） 6mol/L硝酸：量取60 mL硝酸，加水稀释至160mL。

（5） 铜的标准储备液(1000μg/mL)：称取1.000克金属铜（99.99%），分次加入6mol/L硝酸溶解，总量不超过37mL，移1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

可以直接购买该元素的有证国家标准物质作为标准溶液

（6）铜标准使用液：将铜标准储备液用硝酸（1+199）溶液稀释，配制成浓度为0.4、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0mg/L的标准使用液。 四、实验步骤

1. 原子吸收光谱仪分析参考条件

测定波长：324.8nm 灯 电 流：6mA 狭 缝：0.19nm 空气流量：9L/min 乙炔流量：2L/min 灯头高度：3mm 背景校正：氘灯

可根据仪器情况调至最佳状态。 2. 样品消化

称取0.10g～0.50g 试样于消解罐内，加硝酸5mL,1～2mL30%的过氧化氢，盖好安全阀后，将消解罐放入微波炉消解系统中，选择合适的消解条件进行消解，至消解完全，转移到25 mL容量瓶中, 用硝酸（1+199）定容至刻度。同时作试剂空白。 3. 样品测量

将标准溶液、空白溶液和样品溶液依次喷入火焰，测量吸光度。

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4. 绘制标准曲线并查出样液铜元素的浓度。 五、结果计算 1. 数据记录 样品质量m g 样品提取液体积V mL 样液中铜元素浓度C mg/L 2. 计算

C×V X (mg/㎏)= -----------

m

X－试样中铜的含量（mg/kg）； C－样品中检测物浓度，mg/L V－样品体积，mL m－样品质量，g

计算结果保留两位有效数字。 六、思考题

1. 原子吸收光谱仪由哪几部分组成，每个主要部分的作用是什么？ 2. 在原子吸收分析中，为什么常选用共振线作为吸收线？

3. 原子吸收定量分析的依据是什么？进行定量分析有哪些方法？试比较它们的优缺点。

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实验四：食品中甜蜜素的测定

一、实验目的

1. 了解气相色谱仪的使用方法；

2. 了解气相色谱仪的基本结构和原理；

3．学习食品中甜蜜素的气相色谱测定方法。 二、实验原理

在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性和定量。 三、仪器与试剂 1. 仪器

（1）气相色谱仪附氢火焰离子化检测器。 （2）旋涡混合器。 （3）离心机。

（4）10μL微量注射器。

（5）DB-5毛细管柱 30m×0.53mm×0.25μm 2. 试剂

（1）正己烷 （2）氯化钠

（3）层析硅胶(或海砂)。 （4）50g/L亚硝酸钠溶液

（5）100g/L硫酸溶液。

（6）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取1.0000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠10mg。 四、实验步骤

1、气相色谱检测样品参考条件：

（1）DB-5毛细管柱 30m×0.53mm×0.25μm，或相当者。 （2）检测器温度：200℃ （3）汽化室温度：200℃ （4）炉箱温度：60℃ （5）载气流速（压力）：60kPa （6）氢气流速（压力）：50kPa （7）空气流速（压力）：60 kPa 2. 试样制备

称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。 3. 测定

（1）标准曲线的制备：准确吸取1.00mL环己基氨基磺酸钠标准溶液于100mL带塞比色管中，加水20mL。置冰浴中，加入5mL50g/L亚硝酸钠溶液，5mL100g/L硫酸溶液，摇匀，在冰浴中放置30min，并时常摇动，然后准确加入10mL正己烷，5g

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氯化钠，摇匀后振摇80次。待静止分层后吸出正己烷层于10mL带塞离心管中进行离心分离。每毫升己烷提取液相当于1mg环己基氨基磺酸钠，将标准提取液进样1μL～5μL于气相色谱仪中，根据响应值绘制标准曲线。

（2）试样测定：处理过程同标准溶液前处理。吸取的试样提取液1μL注入色谱仪进行分析。

五、结果计算 1. 数据记录 样品质量m g 样品提取液体积V mL 样液中甜蜜素浓度C mg/mL 2. 计算

C×V X (g/㎏)= -----------

m

C—样品中甜蜜素浓度，mg/mL V－样品提取液体积，mL m－样液质量，g

计算结果保留两位有效数字。 六、思考题

1．气相色谱仪由哪几部分组成，各有什么作用？

2．气相色谱定量分析的方法有几种？各有哪些优缺点？

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实验五：乳制品中三聚氰胺的测定

一、实验目的

1. 了解HPLC仪器基本结构,掌握实验仪器的一般使用方法； 2. 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择； 3. 掌握液相色谱定性定量分析技术。 4. 掌握乳制品中三聚氰胺的测定方法 二、实验原理

试样用甲醇-水提取，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱柱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。 三、仪器与试剂

1. 仪器

（1）高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器 （2）分析天平：感量为0.0001 g （3）超声波水浴 （4）涡旋混合器 2. 试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 （1）甲醇：色谱纯 （2）乙腈：色谱纯 （3）柠檬酸

（4）辛烷磺酸钠：色谱纯 （5）离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。

（6）三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。

（7）三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（1+1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

四、实验步骤

1、高效液相色谱检测样品参考条件：

（1）C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，或相当者。

（2）流动相：乙腈+离子对试剂缓冲液(10+90) 恒量流速

（3）离子对试剂缓冲液：10mM辛烷磺酸钠+10mM柠檬酸加1000mL水定容 （4）流速：1mL/min （5）温度：25℃

（6）进样体积：20μL

（7）检测器：DAD检测器 波长236nm

根据保留时间定性，外标峰面积法定量

2. 标准曲线的制备：用流动相将三聚氰胺标准储备液稀释得到的浓度为5、10、20、40、50μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

3. 试样测定：称取试样2克左右样品，移入100mL容量瓶中，加入适量甲醇+水（2+8），

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充分混匀，超声提取10分钟后用甲醇+水（2+8）定容至刻度，过滤，滤液过0.45μm滤膜过滤后进液相色谱测定。 五、结果计算 1. 数据记录 样品质量m g 样品提取液体积V mL 样液中三聚氰胺浓度C mg/L 2. 计算

C×V X (mg/㎏)= -----------

m

X－试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）； C－样品中检测物浓度，mg/L V－样品体积，mL m－样品质量，g

计算结果保留两位有效数字。 六、思考题

1．高效液相色谱仪由哪几部分组成？

2．在高效液相色谱分析中，为什么要对流动相进行脱气？有哪些脱气方式？

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实验六：食品中合成着色剂的测定

一、实验目的

1.掌握聚酰胺吸附法提取色素的样品前处理方法。

2. 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择； 3. 掌握液相色谱定性定量分析技术。 4. 掌握食品中人工合成色素的测定方法 二、实验原理

食品中人工合成着色剂在酸性条件下用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间定性，与峰面积比较进行定量。 三、仪器与试剂 2. 试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 （1）甲醇（色谱纯）：经0.45μm滤膜过滤。 （2）0.02 mol/L 乙酸铵溶液：称取1.54 g 乙酸铵，加水溶解至1000 mL，经0.45μm 滤膜过滤。

（3）聚酰胺粉（尼龙6）：过200目筛。

（4）甲醇-甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60 mL，甲酸40 mL，混匀。 （5）柠檬酸溶液：称取20g 柠檬酸，加水至100 mL，溶解混匀。

（6）无水乙醇-氨水-水（7+2+1）溶液：量取无水乙醇70 mL，氨水20 mL，水10mL，混匀。

（7）pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6。

（8）合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄各0.100 g，置100 mL 容量瓶中，加pH 6水到刻度，配成浓度为1.00 mg/mL 的着色剂水溶液。

也可以直接购买该着色剂的有证国家标准物质作为标准溶液。

（9）合成着色剂标准使用液：临用时将上述溶液加水稀释100倍，经0.45μm 滤膜过滤，配成每毫升相当于10 μg 的合成着色剂。 （10）乙酸 2. 仪器：

（1）高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器 （2）分析天平：感量为0.0001 g （3）电热恒温干燥箱 （4）真空泵 （5）真空抽滤瓶

（6）G3垂融漏斗 四、实验步骤

1、高效液相色谱检测样品参考条件：

（1）C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，或相当者 （2）流动相：甲醇-乙酸铵溶液(PH=4.0,0.02 mol/L)

（3）梯度洗脱：甲醇：20%～35%，5min；35%～98%，5min；98% 继续6 min （4）流速：1mL/min

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（5）检测波长：254nm 2. 样品处理

1、称取20.0g～40.0g,放入100mL 烧杯中，加热驱除二氧化碳。 2. 色素提取

1、聚酰胺吸附法：试样溶液加柠檬酸溶液pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃ pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。约0.45μm 滤膜过滤，取20μL 进高效液相色谱仪分析。 2、测定

取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。 五、结果计算 1. 数据记录 样品质量m g 样品提取液体积V mL 样液中柠檬黄浓度C1 mg/L 样液中日落黄浓度C2 mg/L 2. 计算

C×V

X (g/㎏)= -----------------

m×1000

C—样品中检测物浓度，mg/L V－样品体积，mL m－样品质量，g

计算结果保留两位有效数字。 六、思考题

1、什么是梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？

2、用聚酰胺粉吸附提取色素时，用柠檬酸调整样液的pH 值到6的目的是什么？如何解吸被聚酰胺粉吸附的色素？

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实验七：糖精含量的检测(薄层色谱法)

一、实验目的

1. 学习薄层色谱法测定食品中糖精含量的基本原理。 2. 掌握薄层色谱法的基本操作技术。 二、实验原理

在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，浓缩、薄层色谱分离、显色后，与标准比较，进行定性和半定量测定。 三、仪器与试剂 1. 试剂

（1）盐酸溶液（1:1）

（2）乙醚（不含过氧化物）

（3）无水硫酸钠 （4）无水乙醇

（5）聚酰胺粉：200目

（6）展开剂：正丁醇+氨水+无水乙醇（7+1+2）

（7）显色剂：溴甲酚紫溶液0.4g/L。称取0.04g溴甲酚紫，用乙醇（50%）溶解，加氢氧化钠溶液（4g/L）1.1mL调至pH为8，定容至100mL。

（8）糖精钠标准溶液：称取糖精钠0.1000g，用无水乙醇溶解并定容至100mL。此液含标准精精钠为1mg/mL。 （9）可溶性淀粉

2. 仪器

（1）薄层板10×20cm； （2）薄层层析装置； （3）微量注射器

（4）紫外检测仪：波长254nm。 （5）玻璃喷雾器 四、实验步骤 1. 样品的提取

取 10.0mL均匀试样，置于100mL分液漏斗中，加2mL盐酸（1+1），用30、20、20mL乙醚提取三次，合并乙醚提取液，用5mL盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层。乙醚层通过无水硫酸钠脱水后，挥发乙醚，加2.0mL乙醇溶解残留物，密塞保存，备用。 2. 薄层板的制备

称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7.0mL水，研磨3-5min,立即涂成0.25-0.30mm厚的10×20cm的薄层板，室温干燥后，在80℃下干燥1h。置于干燥器中保存。 3. 点样

点样前对薄层板进行修整，然后在薄板下端2cm 处（用铅笔轻轻画一直线为原线），用微量注射器分别点10μL和20μL的样液两个点，同时点3.0、5.0、7.0、10μL糖精钠标准溶液，各点间距1.5cm。 4. 展开与显色

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将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层0.5cm，展开至上端约8cm，取出薄层板，挥干，喷显色剂，斑点显黄色。根据试样点与标准点的比移值Rf定性。 五、结果计算 原点至溶剂前沿的距离a cm 原点至斑点中心的距离b cm 原点至斑点中心的距离 b Rf=————————————=———

原点至溶剂前沿的距离 a

六、思考题

1. 样品处理时，酸化的目的是什么？ 2. 点样前为什么要对薄层板进行修整？

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