3、计数(加样后静置5min） 4、清洗血球计数板
注：1、活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数时应适当减低视野亮度以增大反差；
2、进行显微计数是应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察计数。
3、酵母菌以每格5到10个菌体为宜。 三、思考题
1、用血球计数板计数时，哪些步骤容易造成误差？应如何尽量减少误差力求准确？ 答：容易造成误差的步骤（1）计数室的清洗（2）加样时是否将菌液摇匀（3）计数 尽量减少误差的措施：
(1)加样前应先镜检计数室，若有污物则需清洗后镜检，直至计数室没有污物； (2)加样前先摇匀菌液，因为放置一段时间的菌液其浓度是不均匀的； (3)计数时先根据计数板的规格确定计数方法：记上不计下，记左不计右。 2、血球计数板计数有哪些缺点？
答：优点是直观、快速、操作简单，可直接观察到微生物的总数，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。 3、利用血球计数板计数时，注入的菌液为什么不能过多？ 答：（1）注入菌液过多，会将盖玻片顶起而改变计数室的容积。
（2）注入菌液过多，也会使计数室中格线变得模糊，无法清楚的计数。
实验九 培养基的制备与高压蒸汽灭菌
一、实验原理
培养基是人工配置的适合我微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大营养物质。一般培养细菌的常用营养琼脂培养基，放线菌常用高氏一号培养基，酵母菌常用麦芽汁培养基，霉菌常用马铃薯培养基（PDA）。 高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min。 二、思考题
1、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多？
答：①分装量太多，三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底。
2、配置培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意什么问题？为什么？ 答：（1）按培养基配方称取所需药品（2）加入少量水溶解（3）待完全溶解后加水补足至所需体积，调节PH（4）分装（5）灭菌 3、试分析培养基灭菌不彻底的原因。 答：（1）装有培养基的试管和三角瓶等在灭菌前没有包扎好； （2）分装时培养基沾在管口；
（3）高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，致使温度没有达到121℃； （4）灭菌锅内物品装的太挤，妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果；
（5）灭菌锅内三角烧瓶与试管口与锅壁接触，冷凝水会淋湿包口的纸而透入棉塞； （6）灭菌结束后，压力未降到0即打开排气阀，开盖取物。这时锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 4、举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养均？其PH值如何？ 答：细菌：营养琼脂培养基 PH 7.0-8.0
放线菌：高氏一号培养基 PH 7.5-8.5
酵母菌：麦芽汁培养基 PH 3.8-6.0 霉菌：马铃薯培养基 PH 4.0-5.8
5、在使用高压蒸汽锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 答：（1）在灭菌前一定要检查灭菌锅中是否有水，若没有水或水不够要及时加水（最好是去离子水）否则灭菌锅可能会烧干而引起炸裂事故。
（2）灭菌结束后，注意压力一定要降到0，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼烧操作者。
（3）灭菌时，旁边一定要有人观察灭菌锅是否处于正常使用状态。
实验十 玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌
一、实验原理
干热灭菌的条件为：160~170℃，维持时间：1~2h ，适用对象：玻璃器皿、金属器皿机械和其他物品（如石蜡油）等的灭菌。 二、思考题
1在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
答：灭菌前：[1]电热干燥箱中玻璃器皿不要放置地过于紧密，否则会灭菌不够彻底 [2]开始灭菌，设定温度为160℃，当干燥箱中温度达到160℃时，灭菌1~2h
[3]注意干热灭菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故，灭菌时人不能离开
灭菌后：[4]不要立即打开电热干燥箱，否则会因为内外温差过大而引起玻璃器皿的破裂，灭菌结束后应先关闭电源，放置一段时间后再拿出。
2为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间要长？ 答：高压蒸汽灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。干热灭菌也是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。细胞内蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，菌体受热时环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固就越快，反之含水量少，凝固慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高，时间更长。 3玻璃器皿为什么在干热灭菌前要先行干燥？
答：干热灭菌温度一般在160~170℃，若玻璃器皿上有过多的水，可能会引起炸裂。
实验十一 微生物接种与培养技术
一、实验原理
只有一种微生物的培养物为纯培养，通常情况下只有纯培养物才能可以提供重复的结果，所以纯培养技术是进行微生物学研究的技术。接种时必须是严格的无菌操作，通常，斜面接种、固体接种、液体接种、穿刺接种均以获得良好的纯种微生物为目的。其中，穿刺接种可以检测出菌体是否有鞭毛以及哪个方向运动。 二、思考题
1、接种前为什么要灼烧接种环？
答：为了保证纯种微生物在接种过程中不被污染（接种前），以及实验操作用的微生物不污染周围环境（接种后），接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。
2、为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上冷却？如何知道接种环是否已经冷却？
答：若不冷却，会烫死菌种；不能直接放台子上冷却，会引入杂菌，若要冷却接种环可以将
其在试管内壁上或者未长菌的培养基上接触一下。当无嗞嗞声或者培养基不熔化是接种环冷却。
3、若你接种的培养物出现杂菌，如何分析引起杂菌的原因？
答：①培养基及相关器皿是否灭菌彻底；②接种器具及接种环境是否干净；③接种操作是否正确规范；④接种后菌的培养是否正确。
4、斜面培养物出现水膜现象，请问如何避免水膜的行成？
答：①斜面培养基灭菌后经过干燥再用于接种；②接种后试管的塞子不要塞的太紧，以防灭菌后所余水及菌种生长旺盛生成的水留在试管内行成水膜。 5、为什么平板培养时需要倒置？
答：空气不易进入，从而不易引入杂菌，特别是在培养厌氧菌时，倒置可隔绝氧气的进入，从而可以使厌氧菌更好的生长。另外，平板培养时倒置可防止平板内微生物进入周围环境中，从而污染空气，特别是一些致病菌。而且，若不倒置，会行成水膜，影响划线。
实验十二 微生物计数技术——平板菌落计数法
一．思考题
1、为什么融化后的培养基要冷却到45℃左右才能倒平板？
答：温度过高会烫死菌种，温度过低则培养基会凝固，不利于培养基与菌液混合均匀 2、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪些关键？ 答：（1）菌悬液细胞密度适宜，稀释倍数适宜；（2）吸样量准确；（3）混合均匀；（4）更换吸管；（5）加培养基时立即摇匀；（6）涂布均匀； 3当平板上的菌落不均匀而是集中的你认为问题在哪？ 答：（1）涂布或倾注不及时；（2）涂布不均匀；（3）没有立即摇匀；（4）菌液过少不易涂布； 4、用平板倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么平板倾注要培养较长时间后观察结果？ 答：（1）平板倾注法：菌落出现在平板表面及内部；涂布法：只在平板表面；（2）培养时间长，菌落的形态特征才明显，便于观察计数。 5平板计数的优缺点有哪些？
答：优点：可直接反映样品中活细胞数量；计数的线性范围大；菌落分布均匀，能较好的反映疏密程度，重复性强，平行性好。
缺点：操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素影响。
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