保护膜以代替失去的结构水膜，保持蛋白质的结构，防止其变性。

“玻璃态”假说：Green等认为海藻糖的高效生物保护作用与它的玻璃态形成有关。当生物成分干燥时，海藻糖紧密地包住相邻的分子，形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似的碳水化合物玻璃体，能够使生物分子维持一定的空间结构。

“优先排阻”假说：Timasheff 等认为海藻糖等小分子糖类不直接与蛋白质空间结构相互作用，而是优先与蛋白质表面的水分子结合，结果蛋白质的溶剂化层半径减小，分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御外界极端环境的影响。

这3种假说的相互补充基本能够解释海藻糖保护生物分子的机制，但是还不能完全解释现有的实验现象，因此，海藻糖保护生物活性物质的机理还有待进一步的研究。

Hino等[20]研究了五株耐冷冻酵母和普通面包酵母，其中两株耐冷冻酵母经过冻融后显示出较高的冷冻存活率和海藻糖含量，而在冷冻敏感菌中海藻糖的含量较低。研究发现，海藻糖并不是所有种属酵母的耐冷冻机制，但一定是面包酵母耐冷冻的重要机制。

Diniz-Mendes等[16]细胞经预先短时温和热处理或预先短时低温冷处理，可以增加酵母细胞在冷冻和冷冻一干燥处理时，对低温的耐受能力，短时间的温和热处理可增加细胞内海藻糖的积累，然而在短时间的低温冷处理时，细胞内海藻糖含量未发生改变。因此认为细胞内海藻糖水平并不是提高酵母冷冻耐性的因素，而是多种因素共同作用的结果。

（2）酵母细胞内的氨基酸库

近年来，日本高木等人在对因类似脯氨酸构造物质产生变异的酵母菌株培养过程中，发现酵母细胞内脯氨酸、精氨酸、谷氨酸等氨基酸的大量积蓄可以提高酵母的耐冷冻性。Takagi等[21]获得1株L-脯氨酸类似物抗性突变株，该突变株能积累较高含量的胞内L-脯氨酸，同时也表现出较高的耐冷冻性能。此外，岛纯等人的研究指出，缺少精氨酸酶遗传因子的生产用面包酵母在培养过程中，酵母细胞内精氨酸和谷氨酸等带电荷氨基酸的积蓄也可以提高酵母菌的耐冷冻性。因此，可以认为，酵母体内脯氨酸和带电荷氨基酸的存在，是酵母耐冷冻性强弱的另一决定因素。Shima等[22]发现带电荷的氨基酸在耐冷冻酵母中有一定的作用，他以商用面包酵母为亲本，构建了精氨酸缺陷型突变株双倍体，此菌株能大量积累精氨酸或谷氨酸盐，用此菌制作的冷冻面团的发酵能力大大增加，说明 car I 基因的缺失可以增加菌株的耐冷冻能力。李楠等[23]利用GC、HPLC和氨基酸分析仪，对选育出的抗冻性面包酵母FTY-5和普通面包酵母的细胞构成成分，即海藻糖含量、脂肪酸组成和氨基酸组成进行了分析和比较。结果表明，FTY-5细胞内海藻糖含量是普通酵母含量的4.6倍。在FTY-5细胞中检出了12种氨基酸，普通酵母细胞中的检出了l1种氨基酸，其中酪氨酸在普通酵母中未能检出。构成FTY-5细胞氨基酸中天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮

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氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的含量比普通酵母高；只有少数几种氨基酸如精氨酸、组氨酸、亮氨酸在酵母FTY-5中的含量稍低。

（3）构成酵母细胞膜的脂肪酸

生物体细胞膜的相变化温度的高低与构成细胞膜的脂肪酸的不饱和程度密切相关，即生物膜带有的不饱和脂肪酸越多，其相变化的温度越低。以面包酵母为代表的啤酒酵母，构成其细胞膜的主要不饱和脂肪酸是棕榈酸和油酸，像亚油酸那样含两个以上双键的不饱和脂肪酸的含量极少。因此可以认为，普通的啤酒酵母之所以耐冷冻性差，是因为构成细胞膜脂质的不饱和脂肪酸的比例少所致。松村等人将Arabidopsisthaliana的不饱和脂肪酸生成酶的遗传基因转移到面包酵母中，改变了构成酵母细胞膜不饱和脂肪酸的比例，从而提高了面包酵母的耐冷冻性。Murakami等[24]研究了冷冻面团中面包酵母不同脂肪成分与耐冷冻能力的关系。研究结果表明，磷脂的成分比例并不影响酵母的耐冷冻性能，但固醇与磷脂的摩尔比对酵母的耐冷冻性能有较大的影响，冷冻敏感株的固醇／磷脂摩尔比比耐冷冻菌株的要高许多。这是因为固醇与磷脂的比例影响酵母细胞质膜的流动性，从而反映了面包酵母的耐冷冻性能的差异。Y．Murakami等[25]对对数生长期的耐冷冻酵母菌Torulaspora delbureckii D2-4和它的冷冻敏感型突变株60B3中的脂质成分进行了比较，以此来推测脂质成分与酵母菌株耐冻性之间的关系。研究表明虽然二者总的脂质含量相同，但是它们的磷脂，中性脂肪以及胆固醇与磷脂之间的比例不同，其中60B3中的胆固醇与磷脂的比例是D2-4的1.7倍，这也就决定了两株菌的细胞膜流动性不同，因此菌株的耐冷冻性也不同。宋振宇等人采用气相、液相色谱法和分光光度比色法，对耐冻面包酵母与普通高糖面包酵母细胞构成成分，即胞内海藻糖含量，脂肪酸组成，麦角固醇，磷脂和氨基酸组成进行了分析与比较，结果表明，耐冻面包酵母海藻糖含量、3种带电荷氨基酸即精氨酸，脯氨酸和谷氨酸的含量、不饱和脂肪酸比例以及麦角固醇的含量均高于普通面包酵母含量。 3 耐冷冻面包酵母的国内外研究

近半个世纪以来，国内外许多实验室在对酵母的耐冷冻机理进行研究的基础之上，采用现代生物技术手段，通过自然筛选、诱变筛选、杂交、基因工程等方法选育出了大量的耐冷冻面包酵母菌株。

Yuji Oda等[26]从300多株酿酒酵母中，根据酵母形态，培养条件和生理特性筛选出11株可应用于冷冻面团的酵母菌株。将筛选出的酵母菌与商业面包酵母的发酵力与海藻糖含量进行比较，发现未经冷冻的酵母菌冷冻前后与商业酵母的发酵力都稍微低一些，但经冷冻的酵母菌发酵力很高，并且筛选出的酵母细胞中比商业酵母含有高含量的海藻糖。这说明，海藻糖含量与冷冻面团中较高的酵母存活率具有一定的相关性。

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美国加利福尼亚的John Kim等[27]通过敲除ATH1基因得到一株Δath1菌，ATH1 基因的缺失使ATH的活性受到严重影响。△ath1菌胞内海藻糖积累量、抗干旱能力、耐冷冻性及对酒精的抗性都明显高于亲本。△ath1菌所具有的较高的存活率可以减少其在冷冻面团中的用量，使其在具有很好的商业价值。

Shima[28]等通过基因敲除技术，得到Δath1、Δnth1 及Δath1Δnth1 三株面包酵母菌，通过与亲本的发酵力、耐冷冻能力及抗干旱能力比较发现，三株菌的耐冷冻能力、发酵力均高于亲本，三株菌在普通面团中冷冻两周后，发酵力几乎没有改变，这是因为海藻糖酶基因发生突变，其胞内海藻糖的降解被阻断。但Δath1、Δnth1 的抗干旱能力强于亲本，而Δath1Δnth1 的抗干旱能力弱于亲本。

许春英等[15]采用耐酒精度实验，筛选出了一株抗冻性面包酵母菌，其冷冻3周后的存活率大于80%，冷冻面团应用实验表明, 该酵母抗冻性良好，具有实用价值。

Tanghe A等[29]认为质膜的水运送是决定耐冻性的关键因素，Aquaporin基因的缺失使得菌株对冷冻更加敏感，相应基因的过表达可以增加冷冻耐受性。由于Aquaporin的过表达不影响酵母的其它特性，为耐冷冻酵母菌种的选育开拓了一条新的途径。

江正强等[30]从土壤、谷物、果蔬、空气等不同来源筛选分离得到60多株酵母菌，通过模拟面团预发酵进行耐冷冻酵母菌的初筛选，并通过普通面团预发酵进一步筛选，得到了3株耐冷冻酵母菌，这3株耐冷冻酵母菌冷冻7d后存活率和相对发酵力均超过80％，且海藻糖质量分数大大高于耐冷冻性较差的酵母菌，其质量分数最高达16.2％。

李楠等[31]通过对实验室保藏和市售的面包酵母进行耐冻性测定，以存活率为主要指标，在接近实际生产和贮存的冷冻温度下(–20℃ )，选育出了耐冻性面包酵母FTY-5，并且通过冷冻贮藏、耐糖性、产气性和生长曲线测定等实验对该菌株的特性进行了研究，发现选育出的FTY-5菌株具有良好的耐冻性，在–20℃下冷冻贮存56d，冷冻存活率仍能达到92％，发酵力仍能达到原发酵力的82％。

姜天笑等[32]通过对酵母在普通面团中冷冻后的相对发酵力、在液体模拟面团中冷冻后的相对发酵力和酵母细胞冷冻存活率之间的比较，发现3者之间具有显著的线性正相关性，并且通过不同预发酵时间、胞内海藻糖含量对酵母耐冷冻能力的影响，建立了一种评价酵母耐冷冻性能的方法。另外发现应用液体模拟面团测定酵母耐冷冻能力的方法简便、易控制，可用于耐冷冻酵母菌种的选育和耐冷冻酵母产品的检测中。

刘青等[33]以海藻糖分解酶活力初筛平板为“筛子”，并以预发酵前后胞内海藻枯含量、冷冻存活率以及在冷冻面团中的发酵力为主要指标，选育出2株耐冷冻性良好的菌株，这2株突变株在-20℃下冷冻28d后存活率分别为97.4%和97.%，冷冻面团发酵力分别比亲本菌株提高了57.5%和40%,

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国内外研究工作者都致力于耐冷冻酵母菌株的选育以及耐冷冻机制的研究，以冷冻存活率、海藻糖含量以及冷冻前后相对发酵力为指标选育出了大量的耐冷冻酵母菌株，但是对于酵母耐冷冻性能与其耐高渗以及耐温性能之间的关系还有待研究，这一问题的解决将会有利于人们更快的选育出耐冻酵母。

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