核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素
中国人民解放军第302医院 王海滨
一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战
（一）国家药监局审评中心新行规：核酸提取是关键！ 1. HBV DNA 敏感性报告 <30IU/ML ，防止实验室污染问题！ 2. 标本加样量不少于 200 微升；干扰与敏感性的矛盾！ 3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升！ 4. 磁珠法应用的挑战！血站核酸筛查？ 5. 定量内标漂移对结果的影响
6. 试剂盒考核：增加抗污染和敏感性能评价指标！ （二）不同核酸提取方法对检测质量的影响
影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。
标本： 200 微升血清
方法：磁珠法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 层析柱法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 碱性裂解法： PEG 介导； 生物合成材料：无胍、无醇。
PCR 扩增：取等体积提取核酸或磁珠悬液（ 10 微升），同一 PCR 扩增液。 我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。
过去，我们对荧光 PCR 试剂或分子生物学试剂，往往关注扩增部分，而把提取部分忽视了，现在来看，提取部分也非常重要。
二、临床实验室核酸制备方法分类 （一）临床实验室核酸制备基本方法 基本的方法有四种： 1. 煮沸法
最常用的是 PEG 聚乙二醇 6000 ，血清和提取液混匀，之后使病毒沉淀，离心，然后对沉淀物进行高热电解试验。
有文章提出，弃掉的上清含有的病毒更多。 2. 一管法
血清加到微量的裂解液里面混匀，试液配好以后，加进去就可以了。目前市场上有几家公司都用该检测方法。从临床检验的角度来说，一管法略微简略。但是敏感性，已经达到了 100IU ，而且其稳定性非常好。不用煮沸，或者经过简单的煮沸。虽然目前药监局审评中心，不提倡用一管法，但是一管法的稳定性，抗污染性，简易程度，实际上优于磁珠的方法。因为磁珠非常小，而且在乙醇下，非常容易挥发，易导致实验室的污染，
3. 层析柱法
层析柱法优于磁珠法，没有发生漂浮的情况，虽然也可以导致污染，但污染源限于液体，即使用试剂中的污染物 。比如普通的筛查，建议大家用一管法来做，毕竟经济、简便、快速等，敏感性达到 100IU ，也能满足临床的需要。
（二）磁珠或层析柱胍盐提取核酸多步骤的弊端
乙醇在核酸提取中的利与弊的关系，由于乙醇容易蒸发，在磁珠里面的乙醇容易挥发造成污染。大家不妨做一个试验，在乙醇里面加上磁珠，放在玻片上，在显微镜下看一看，可以看到在乙醇里面的磁珠就像巨峰一样，波涛汹涌。在玻片边缘的磁珠，随着乙醇蒸发而迸溅。所以，很容易发生交叉污染，而且非常严重。磁珠和层析柱方法关联的次序，有病毒裂解，然后核酸吸附，还有漂洗，最后是洗脱。目前诊断试剂 HBVDNA ， HCVRNA ， HIVRNA 等，第一个过程是病毒裂解以后，把磁珠收集了，然后漂洗、洗脱。
（三）层析柱法核酸丢失 1. 过滤核酸丢失
PPT6 显示的是过滤液再过柱 5 次取得核酸，第一次过滤的液体，为 1 虑，再过滤一次，为 2 虑，然后反复一直到 5 虑。图中是高含量、中含量与低含量，低含量是 100IU 左右，也就是说，滤下来的东西再过滤，还有核酸被收集到的，这就是核酸的丢失。
PPT7 显示的滤过液再进行核酸提取 5 次数据，通过计算发现，丢失率为 60% 以上。
PPT8 显示的是 5 次过滤丢失的曲线图，过滤液中存在核酸的丢失，不同浓度标本的核酸的丢失差异较大。
2. 洗脱核酸丢失
PPT9 显示的是层析柱反复洗脱核酸的丢失，进行了七次洗涤。结果发现第一次洗脱核酸量较高， 2 洗到 7 洗，核酸含量基本上差不多，这也是丢失的环节。
PPT10 显示的是层析柱反复洗脱核酸数据。
PPT11 显示的是 7 次洗脱核酸丢失率的图，不同浓度标本中层析柱上的残留核酸，差异也较大。
PPT12 显示的是高浓度标本反复洗脱得到的 PCR 曲线和 Ct 值，进行了 17 次洗脱，可以看到，从第九次或者第八次以后，基本上在 18 、 19 左右徘徊，即最后会达到一个平台，说明层析柱粘附的核酸量非常多。
PPT13 显示的是 洗脱液加热对照得到的 Ct 值， 可以看到，加热洗脱，核酸洗脱下来的量明显升高。
（四） PEG 提取法核酸丢失情况
PPT14 显示的是 PEG 提取法核酸的丢失， PEG 和血清或血浆混匀以后，沉淀的上层还含有大量的病毒。 PEG 存在很多的问题，沉淀很难再混匀，故每次检测结果可能明显的不同，这也是 PEG 的方法最后被取消的原因之一。
（五）血清标本 干扰物质 对荧光 PCR 检测的影响
PPT15 显示了干扰物质的罗列，分为溶血组、脂血组、黄疸组，及对照组。可以看到，这三种方法是可比的。干扰最大的是黄疸组，但是这几个方法的比较呢，实际上没有质的差异。
PPT16 显示的是两个一管法的比较，可以看到，一管法 1 有一个特点：干扰物质的影响不大。但是一管法 2 干扰物引起波动。
由于一管法 1 中的蛋白做了消融，一管法 2 在室温混匀以后，直接加反应液，故有差异。因此在临床上，更为主张采用一管法 1 ，也就是做温处理，使里面的干扰物质清除。
（六）不同核酸吸附材料（磁珠）
PPT17 显示的是不同核酸吸附材料的影响，实验中用了两种不同的裂解液与两种不同的磁珠：
1. 磁珠 1
不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本都一样。 2. 磁珠 2
不同裂解液比较发现，高中低拷贝的标本明显不同。 说明磁珠的材料对检测结果的影响很大。 （七）同一试剂，不同核酸提取方法
不同的提取方法，核酸的丢失也不一样。提取样本量与核酸得率的关系，是 1 ＋ 1 ≠ 2 现象，即加入的血清量，并不是越多越好，比如加 100 微升或 50 微升的血清，并不是加 100 微升血清核酸提取得率，一定是加 50 微升血清的一倍。实际上有时血清加的越多可能干扰物质越多，这要通过不同的实验进行验证。 对 100 μ l 高中低含量 HBV DNA 血清采用 COBAS TaqMan 、罗氏 Meg 2.0 核酸提取仪和本实验室建立的磁珠法进行核酸提取，同时采用同一试剂进行定量。 试验发现有的核酸提取方法，核酸丢失率非常大。
三、核酸提取的交叉污染 （一）仪器核酸提取的交叉污染