膜片钳常见问题解答（一）

1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？

答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。 2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？

答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S， 1,000 pS＝1 pA/mV。

3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?

答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。

4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？ 答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。 5. 什么是ramp？有什么作用？

答：与步阶（step）不同，ramp在pClamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V曲线。

膜片钳常见问题解答（二）

6. input resistance是什么意思？如何测量？

答：在电生理学中，“input resistance”指“输入膜电阻（Rin）”。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。膜电阻（Rm）与膜输入阻抗Rin的关系为：Rm＝4πr2 Rin，r为细胞半径。

7. 在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？

答：在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex软件中的菜单Tools/ Junction Potential功能对其测算，然后决定是否需要校正。 8. Decay是什么意思？和inactivation有何区别?

答：Decay是“衰减”之意，inactivation是“失活”之意，但在文献中经常混用，decay也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。但实际上，两者细分的话还是有区别的。可以将Inactivation分为稳态失活与非稳态失活。后者即Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steady-state inactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。 9. 什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？

答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活(Deactivation)，所记录到的电流称为尾电流（Tail current），主要反映通道的关闭特征。延迟整流性K+离子通道以及一些不同类型的Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而

获得通道关闭过程的时间常数。

尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。

10. 如何理解steady state activation中的steady state 的意义？ 答：“steady state”是“稳态”的意思。一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。

膜片钳常见问题解答（三）

11. 电极拉制程序中具体应该如何控制。在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.

答：不同的拉制仪拉制参数的设置不尽相同，你需要阅读说明书，参数中主要是设定拉力（对于P-97拉制仪，只需要设置Velocity，可不用设定Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97拉制仪，温度的设定需要先测量Ramp值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。

12. Rm＝4πr2Rin？似乎Rin是一个用细胞大小标化的膜电阻，那为什么不用电容Cm来标化而用这个什么4πr2？细胞形状各异，Cm是个公认的膜面积的指标，电流密度不就是用Cm标化的吗？盼回答，同时希望能将Rin的意义再多讲一点，谢谢

答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin这两个符号，文献中常混用，但实际上表示的大多是Rin。通常我们所说的“膜电阻”是指“膜输入阻抗Rin”，但也有人用来指Rm。（2）你可以用Cm来计算膜面积，实际上这也正是我们的

做法，用来估算细胞大小，用于对通道电流幅度进行标化，但我们从来不用它计算膜电阻Rm（也称为“固有膜电阻”）。Rm的计算公式是数学理论上的，并没有多少应用的价值，我们很少发现有使用Rm的（虽然符号用Rm）。（3）实际上，Rin反映的当然就是膜电阻，它被称为膜输入阻抗（或膜输入电阻），也时常被称为“膜电阻”（这正是使人们产生混淆的原因！），是膜的被动反应参数之一。所谓被动反应是指膜上离子通道没有开放时，膜所表现出的电缆特性。膜的被动反应参数还包括膜电容、轴浆电阻等。全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（多为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律可求出Rin。当大量离子通道开放时，膜对电流的阻力急剧降低，测试脉冲电压与通道电流之间不满足欧姆定律，无法测量Rin，也没有了测量的意义。

13. 请教什么是Channel availability？

答：Channel availability指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。例如，海马神经元Na通道的channel availability可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。

14. 什么是window current，我知道是激活曲线和失活曲线的重叠。但是我有一个疑问，比如电压依赖的T型钙通道，书上说在windonw current的时候有持续性的钙内流，但是T性钙通道不是有时间依赖性的失活吗？怎么会有不失活的电流呢？

答：如果将通道的稳态激活曲线与失活曲线作在一个图上，则激活曲线与失活曲线之间交叉部分的电流就是window current，在这个电压范围内，有一些通道并没有完全失活，仍能被打开，有一定的开放概率。T性钙通道是有时间依赖性的失活，但还有很小的部分失活非常缓慢，此即window current，它是一些快速失活通道的动力学特征。对于T型钙通道，其window current维持了一个紧张性去极化，对动作电位的连续发放产生影响，当然，不同细胞中的T通道其作用不尽相同。

15. 使用Clampex 8.0记录配体门控离子通道电流，protocol 如何设置? 答：需要事先在Lab Bench中设定好Channel序号和Signal名称。在Edit