实验一 常用培养基的制备技术及应用

一 实验目的要求

1．掌握培养基的概念和分类。

2．掌握常用培养基制备的一般程序。 3．熟悉常用培养基的制备技术和用途。 二 实验原理

培养基（culture medium）是根据微生物生长繁殖所需要的一定比例的营养物质（碳源、氮源等）、氢离子浓度（pH值）以及渗透压等条件，用人工方法制成的无菌营养基质。主要用于微生物分离培养、生化鉴定和保存菌种等。

培养基按物理性状不同可分为固体、半固体和液体培养基；按性质和用途不同又可细分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基和特殊培养基。根据物理性状和用途等不同常将培养基分装于试管或平皿等容器中。

常用培养基制备的一般程序是：调配成分?溶解?较正pH值?过滤?分装?灭菌?质量检验?保存。配制培养基时可以按照培养基配方调配各种基本成分，也可购买半成品的商品培养基干粉制剂直接配制。

三 器材与试剂

１．试剂 普通营养琼脂干粉、脱纤维羊血、半固体培养基、SS培养基干粉、克氏双糖铁培养基干粉、1 mol/L NaOH溶液、麦康凯培养基成分（蛋白胨、氯化钠、胆盐、乳糖、5 g/L中性红水溶液、琼脂粉）、蒸馏水。

２．器材 小型药物天平、药匙、称量纸、三角烧瓶、量筒、吸管、精密pH值试纸试管、硅胶塞、牛皮纸（或报纸）、棉线、玻璃棒、玻璃纸、无菌平皿、高压蒸汽灭菌锅、微波炉等。

四 步骤与方法

１．常用培养基制备的一般程序及方法

１）调配成分 根据培养基配方或用法，准确计算、称量所需培养基各基本成分或干粉制剂，装于三角烧瓶中，加入定量蒸馏水充分混合。

２）溶解 将盛有混合物的三角烧瓶置于沸水浴或流动蒸汽灭菌器中加热溶解，呈半透明状。

３）校正pH值 即将培养基pH值校正到适合细菌生长的最适pH值，一般病原菌的最适pH值为7.2～7.6。校正培养基pH值的常用试剂有1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L NaCO3溶液和1 mol/L HCl溶液（注意：培养基高压灭菌后， 用NaOH和HCl校正的pH值会下降0.1～0.2，而用NaCO3溶液校正的pH值会上升0.1～0.2）；校正培养基pH值的方法常用精密pH值试纸法、比色法和电子pH计法等。

４）过滤 培养基中若存在杂质或沉淀物时则需要过滤澄清。液体培养基用滤纸趁热过

滤，固体培养基用双层纱布夹脱脂棉趁热过滤。

５）分装

（１）液体培养基、半固体培养基 灭菌前分装于洁净试管中，分装到试管的下1/4～1/3处，加塞，5～10支试管用牛皮纸盖帽，棉线扎捆，标明培养基名称、制作日期。灭菌后直立放置。

（２）固体斜面培养基 灭菌前分装于洁净试管中，分装到试管的下1/3～1/2处，加塞，5～10支试管用牛皮纸盖帽，棉线扎捆，标明培养基名称、制作日期。灭菌后趁热摆成斜面，斜面长度为试管长度的2/3，并保持斜面下端距离管底有1 cm以上柱高，同时斜面上端距离试管塞1 cm以上。

（３）琼脂高层培养基 灭菌前分装于洁净试管中，分装到试管的下2/3处，加塞，5～10支试管用牛皮纸盖帽，棉线扎捆，标明培养基名称、制作日期。灭菌后直立放置。

（４）固体平板培养基 将培养基分装于三角烧瓶（培养基的量要小于三角烧瓶最大容量），先用玻璃纸或棉塞封口，再用牛皮纸盖帽、棉线扎口。灭菌后将培养基冷却至50 ℃左右，以无菌操作，倾注于平皿内（内径为9 cm的平皿倾注15～20 mL培养基），马上水平旋转1～2周，使培养基均匀平铺于皿底。待培养基凝固后，在皿底面上标明培养基名称、制作日期，底上盖下倒置保存。

６）灭菌 根据培养基中营养物质耐热性的不同分别采取相应的物理灭菌法

（１）培养基成分均耐高热时常用高压蒸汽灭菌法，这也是最常用、最可靠的培养基灭菌方法。常用灭菌条件为103.43 kPa（121.3 ℃） 15～20 min；含糖培养基用68.95 kPa（115.6 ℃） 10～15 min，以免破坏糖类物质。

（２）培养基中含有不耐高热营养物质（如糖类、明胶和牛乳等）时，常用流通蒸汽灭菌法，方法是80～100 ℃加温30 min，每天1 次，连续3 d。

（３）培养基中富含蛋白质（如血清或鸡蛋清）时需用血清凝固器灭菌，方法是将需灭菌的培养基摆放在血清凝固器内（一般做成斜面），第一天75 ℃加热30 min，第二天80 ℃加热30 min，第三天85 ℃加热30 min，在3 次灭菌间隙将培养基取出，置35 ℃恒温箱中过夜。

（４）对液态高营养的不耐热培养基，如血清、细胞培养液等，可采用滤过除菌。 ７）质量检验 制备好的培养基须经性状检查、无菌检验和效果检验均合格才可使用。 （１）性状检查 液体培养基应外观清澈透明；半固体培养基应质地均匀，呈半固态；固体斜面培养基应质地均匀，凝固后斜面稳定，不下滑；平板培养基应质地均匀，表面光滑、平整，薄厚适宜。

（２）无菌检验 将制备好的培养基置于35 ℃培养24 h，以无任何细菌生长为合格。 （３）效果检验 将已知的标准菌株接种于待检培养基中，经培养后检查标准菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果符合。

８）保存 制备好且标记清楚的培养基置于4 ℃冰箱保存备用，严格灭菌后的培养基一般可保存1 周以上，但不宜过久。注意平板培养基应底上盖下倒置保存，以防止盖内水蒸汽落在培养基表面，使得培养基表面粘滞易污染且不易接种；液体、半固体等培养基应直立保存。

２．常用培养基的制备技术

１）营养肉汤培养基 用量筒准确量取所需蒸馏水，先倒入三角烧瓶一部分，随后按照营养肉汤成分配方（蛋白胨 10 g，牛肉浸出粉 3 g，氯化钠 5 g，蒸馏水1000 mL见附录一）或干粉制剂说明书用法准确计算、称量所需粉剂，置于已经盛有部分蒸馏水的三角烧瓶中，最后将量筒内剩余蒸馏水全部倒入三角烧瓶，充分混匀、加热溶解后，用1 mol/L NaOH校正pH值到7.5～7.6（高压后可降到培养基要求的7.4），分装于试管中，加塞扎捆标记后高压蒸汽121 ℃灭菌20 min。取出后直立放置，待冷却后置于4 ℃保存备用。可用于一般细菌的增菌培养。

２）营养琼脂培养基 用量筒准确量取所需蒸馏水，先倒入三角烧瓶一部分，之后按照营养琼脂成分配方（蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL见附录一）或干粉制剂说明书用法准确计算、称量所需粉剂，置于已经盛有部分蒸馏水的三角烧瓶中，最后将量筒内剩余蒸馏水全部倒入三角烧瓶，充分混匀、加热煮沸溶解后呈半透明状，校正pH值到7.2～7.4。若制作固体斜面则先分装于试管中，加塞扎捆标记后高压蒸汽121 ℃灭菌20 min，高压后趁热摆成斜面，凝固后置于4 ℃保存，可用于一般细菌菌种的传代保存；若制作固体平板，则直接封装在三角烧瓶中，高压蒸汽121 ℃灭菌20 min，灭菌后以无菌操作倾注平板，待凝固后标记、倒置于4 ℃保存，可用于对营养要求不高细菌的分离培养和纯化。

３）半固体营养琼脂培养基：配方见附录一是蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂粉5 g，蒸馏水1000 mL，pH为7.4，具体做法同肉汤培养基。可用于观察细菌的动力和保存菌种。

４）血琼脂平板 将灭菌后的营养琼脂冷却到50 ℃左右，以无菌操作加入10%的无菌脱纤维羊血（或兔血），立即混匀，避免产生气泡，然后以无菌操作分装于无菌试管或平皿，制成血琼脂斜面或血琼脂平板。血琼脂斜面可用于保存营养要求高的细菌；血琼脂平板可用分离培养细菌和检测其溶血性。

５）巧克力琼脂平板 是基于血琼脂平板制备基础之上，特点在于灭菌后的营养琼脂冷却到70～80 ℃时加入无菌脱纤维血液，且在80 ℃水浴中摇匀15～20 min，使血液的色泽由鲜红转变为巧克力色，然后冷至50 ℃左右，以无菌操作倾注平板即制成巧克力琼脂平板。可用于分离培养奈瑟菌属、流感嗜血杆菌属等对营养要求较高的细菌。

６）麦康凯琼脂平板 按照配方基本成分（（蛋白胨20 g，NaCl 5 g，胆盐5 g，乳糖10 g，5 g/L中性红水溶液5 mL，琼脂20 g，蒸馏水 1000 mL见附录一）自行配制时，先将

除乳糖、中性红之外的成分混合加热溶解，调pH7.2之后，再加入乳糖、中性红，混匀后高压灭菌115 ℃ 15 min，取出冷却至50 ℃左右，以无菌操作倾注平板，凝固后标记、倒置于4 ℃保存，可用于肠杆菌科细菌的分离培养与鉴定。

五 注意事项

１．要防止加热溶解时培养基粘瓶底烧结，可先在三角烧瓶底部加入部分量好的蒸馏水，再加入称量好的固体成分，最后将量筒内剩余的蒸馏水全部倒入三角烧瓶。

２．制备培养基最好用玻璃器皿（烧瓶、烧杯）。若制备大量培养基时可用铝锅或搪瓷桶，但不能用铁、铜器皿，因为铁离子进入培养基，达到一定浓度会抑制细菌生长，而铜离子会抑制细菌毒素产生。

３．在按照配方自行配制培养基时，若培养基中有染料、胆盐和指示剂等成分，应在校正pH值之后加入。

４．倾注平板时，一定要无菌操作，最好在无菌设备中进行，倾注时平皿开口越小越好，能倒入培养基即可，以防止空气中的微生物尘埃等污染培养基。

５．倾注平板时，灭菌后的培养基要冷至50℃左右再倾注平板。若温度过高，平板会出现很多冷凝水，不宜长期保存；若温度过低，则培养基在未倾注前就会出现凝块，倒入凝固后培养基表面会凹凸不平。