为模板按列反应体系进行扩增

槿拯 坠加水至总体积为 轻轻混合预变性 变性退火延伸 至个循环℃终木延伸 产物用琼脂糖胶电泳分析

荧光素酶报告基因检测在孔或孔板中接种细胞使小时后汇合率为瞬时转 染荧光素酶报告基因和的基因 小时后裂解细胞采用公司

双荧光报告基因检测试剂盒进行检测 细胞增殖速率比较

取对数生长期细胞传代消化以每孔个的密度接种入孔板并设 个复孔在后加入十分之一体积的工作液孵育小时后放 入酶标仪以波长检测取平均值比较差异 体外侵袭实验

基质胶准备将冻存于度冰箱的 度过夜变成液态

取无血清培养基加入或每室混匀

操作最好在冰浴上加入上室各个室放入培养箱中 孵育此间经常观察当出现白色层时说明已经变为固态 注释无血清培养基和基质胶按稀释每孔加在℃培养箱中

消化细胞无血清培养基洗次计数配成细胞悬液

用无血清培养基洗洗次每孔加入细胞悬液第二军医大学博士学位论文 下腔室中加入含有条件培养基 ℃培养箱中孵育 取出用洗遍 戊二醛固定 加入结晶紫染色或染色室温洗

遍用棉球擦去上表面细胞显微镜下观察取随机个视野细胞计数 染色质免疫共沉淀

部分剪切×细胞

于培养瓶中准备×细胞培养基为 甲醛℃置 直接加入

于冰上终止反应尽量吸尽培养基用含冰冷洗涤次 管

反复吹打细胞吸取悬液移入 ℃离心融化裂解液并加入和 裂解液再悬细胞冰上 ×次间隔

冰上超声剪切至大小 加入 ℃以解除交联

苯氯仿法提取琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果

注

卜注意冰上操作

通过改变超声功率间隔次数优化条件通过电泳判断片段大 小经验表明尖端最大功率间隔次可使之优化 一旦优化则固定细胞数量 部分免疫共沉淀

接 离心转移上清至离心管

稀释缓冲液稀释上清至体积并加入蛋白酶抑制剂 从中取出进入用于定量

加入蛋白鲑精琼脂于稀释上清以纯化摇动选 中速下同

离心以沉淀琼脂转移上清于新管×

加入抗体摇动过夜

背景对照则不加抗体直接使用蛋白鲑精琼脂摇动 直接 进入

加入蛋白鲑精琼脂摇动以收集抗体转录因子复合体 在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 离心以沉淀琼脂尤其小心移除上清内含未结合及非 特异可提取并按以下顺序洗涤蛋白鲑精复合 体每种缓冲液加室温摇动 离心

①低盐免疫复合体洗液次 ②高盐免疫复合体洗液次 ⑨免疫复合体洗液次 缓冲液 次

注步取出上清用于不同样本定量此作为 ℃置以解除蛋白交联见 初始样本而且需要通过加入

经过后样本为蛋白抗体转录因子复合体 部分沈脱结合于转录因子的

按体积配制

配制新鲜洗脱缓冲液和

接加入沈脱液以使转录因子复合体与蛋白抗体解离 简单振荡混匀室温摇动 离心以沉淀琼脂小心

转移上清于新管并重复沈脱次混合次洗脱上清 以解除转录因子交联置 加入

此后样本可放入一于明同进行后续实验应同时包括的初 始样本阴性对照和背景对照组样本用于巢式

若结果不理想可进行下面步骤以纯化注意小心操作某些