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研究方法 针咒万法 标本来源及处理

人神经胶质瘤石蜡包埋组织标本来例源于年月至年月在

长海医院神经外科手术切除的患者经病理组织学检查确诊其中分级 Ⅳ级例其余均为Ⅳ级下常对照两例于正常脑组织内减压术中获得 冰冻组织标本例其中分级级例Ⅱ级例Ⅳ级例Ⅳ 级例正常对照组织例 免疫组织化学

石蜡切片烤箱过夜 切片脱腊至水

二甲苯①一二甲苯②一二甲苯③一乙醇第二军医大学博士学位论文 乙醇一乙醇一乙醇一双蒸水 甲醇液室温放置 × 双蒸水洗 抗原修复

切片放入柠檬酸盐缓冲液中煮沸停火再煮沸 自然冷却至室温双蒸水沈 封闭 ℃

甩去封闭液不洗直接加一抗置入湿盒中 然后冰箱过 夜时

℃取出室温复温 × 然后 洗 滴抗 ℃

沈 ×显色 镜下观察 双蒸水终止显色苏木素复染秒 分化后自来水返蓝蒸馏水浸泡 脱水透明盖玻片覆盖

显微镜下观察阳性染色在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究

免疫印记

取等量神经胶质瘤组织液氮中磨碎 加入裂解缓冲液冰浴超声破碎细胞 置恒温离心机内离取上清

蛋白定量试剂盒进行蛋白定量取出所需量蛋白加入加样缓冲液 变性

变性样品进行蛋白电泳

通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜 公司 脱脂奶粉封闭洗三次每次 稀释一抗孵育洗三次每次

脱脂奶粉稀释二抗孵育 洗三次每次 化学发光法显影 细胞培养

胚肾上皮细胞入神经胶质瘤细胞细胞用培养 置孵箱中培养保持饱和湿度

消化取待传代细胞培养瓶皿轻弃培养基预温少许轻洗一遍 弃去加少许胰酶室温放置数分钟至瓶壁出现针孔样

弃去胰酶加少量新鲜培养基终止消化轻轻吹打待成单个细胞后传代 冻存生长对数期细胞约×胰酶消化数分钟用完全培养基中 止吹打成单个细胞离心分钟将细胞沉淀悬浮于冻存 液胎牛血清中转移到冻存管中小 时一℃小时液氮管而后放进液氮中

复苏准备 温水视复苏细胞管数多少将从液氮罐中

取出的细胞迅速在水中融化不断搅动转移细胞于加有新鲜完全培养 液的培养瓶中培养次日更换培养液 质粒的构建

启动子区报告基因质粒及突变体质粒的构建方法

启动子区全长及各突变体质粒物见下表其中各突变体质粒采用第二军医大学博士学位论文

重叠延伸法进行构建条件如下变性℃退火℃ 延伸℃个循环电泳鉴定

构建方法上游引物均引入 酶切位点下游引物均引入酶切 位点得到的产物进行胶回收再用 酶切与用同样双酶 切酶切回收后的质粒进行连接转化感受态菌氨苄抗生素 筛选阳性克隆用酶切初步鉴定正确后再送测序鉴定确认突变 位点正确后再用于后续实验 质粒名称 引物 一 一