预防医学专业《流行病学》实习指导

2.血糖试验

3.并联试验（尿糖与血糖）

4.串联试验（尿糖与血糖）

5.与单一的试验方法相比，两种合并试验法的灵敏度和特异度有何改变？

6.如果某病没有有效的治疗方法或对检出的阳性者医疗照顾的条件很有限，在这种情况下，你认为普查的意义如何？

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实习五 分子流行病学实验

——铜绿假单胞杆菌外膜脂蛋白Opr I基因的扩增 1.实验目的

铜绿假单胞菌是医院感染最常见的病原菌之一，可引起各部位的感染及败血症，被认为是临床各科医院感染的棘手问题。早期明确诊断，及时有效选用抗菌药物治疗是控制铜绿假单胞菌感染的关键。选择铜绿假单胞菌外膜脂蛋白I (Opr I)基因片段，合成1对引物，对临床标本进行预处理提取DNA模板，进行聚合酶链反应(PCR)扩增，用凝胶电泳分析，进行铜绿假单胞菌感染的初步检验。 2．实验内容

（1）菌株：铜绿假单胞杆菌 CMCC 10211-8，购自中国药品生物制品检定所，相当于Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853。 （2）引物：引物序列如下：

Ps1 5' ATGAACAACGTTCTGAAATTCTCTGCT3 '（上游） Ps2 5’CTTGCGGCTGGCTTTTTCCAG3'（下游） （3）其他

2× Taq Master Mix（内含Taq DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液） 核酸染料GELVIEW 1×TAE缓冲液（电泳缓冲液） DL2000 DNA marker 琼脂糖粉

3.方法步骤：

（1）标本处理及DNA的提取

取痰液标本于1.5ml离心管中，100℃煮10 min , 10 000r/ min离心10 min , 取上清液作为模板DNA , 铜绿假单胞杆菌标准菌株ATCC27853作为阳性对照，无菌超纯水作为阴性对照。 （2）准备20 μl PCR反应体系

取三个PCR管，标记为1、2、3，分别为样品、阳性对照和一个阴性对照，即体系中的DNA模板分别为样品、铜绿假单胞杆菌和灭菌双蒸水。在标记好的PCR管内，按表配制20 μl 反应体系：（整个过程要在冰盒上进行）

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试剂 灭菌双蒸水 2×Taq Master Mix

DNA模板 10 μM Primer F 10 μM Primer R

合计

体积（μl）

8 9 2.0 0.5 0.5 20

加完轻弹混匀、轻离心后，放入PCR仪。 （3）PCR反应热循环程序： ① 94 ℃ 预变性 30 s ② 94 ℃ 变性 30 s ③ 60 ℃ 复性 30 s 25个循环 ④ 72 ℃ 延伸 1 min ⑤ 72 ℃ 延伸 5 min ⑥ 4 ℃ 保存 将加好样的PCR管放入PCR仪中后，在面板上按照上述条件设置好程序后，按启动键开始热循环反应。 （4） 配制1％琼脂糖凝胶 将称好的琼脂糖粉放入三角烧瓶中，加入1×TAE缓冲液，摇匀后放入微波炉中煮沸三次，凉至不烫手时加入核酸染料（终浓度0.5μg/ml）摇匀，倒入提前插好梳子的胶板槽中，置于平面上待凝（室温下约15分钟）。 溶胶凝固后，将梳子垂直拔出将凝胶放入电泳槽中，加入适量的1×TBE缓冲液，液面高于凝胶。 （5）PCR产物检测

用10μl移液枪分别吸取5 μl PCR扩增产物，按照阴性对照、样品和阳性对照的顺序点入凝胶孔内，再取1.5μl DL2000 DNA Ladder点入凝胶孔内作为分子量标准。

电泳时设定电压为100V，并设定为电压恒定模式。

13、待样跑至距离凝胶边缘约1厘米时停止电泳，将胶置于紫外凝胶成像仪下观察结果，以出现249 bp条带为阳性结果。

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4、实验结果及分析（说明阳性管结果和阴性管结果并报告样品检验结果）

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