2仪器设备

氧电极仪，记录仪，电磁搅拌器，超级恒温水浴，微量注射器，容量瓶，反应杯。 3试剂

3.1实验试剂 亚硫酸钠，过氧化氢酶，50 mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0），50mmol/L过氧化氢溶液（取1.4ml30℅H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml），标准过氧化氢酶溶液[称取过氧化氢酶1.0mg(110U/mg),溶于50磷酸缓冲液（PH=7.0）11ml中，使酶浓度为10U/ml]. 3.2实验材料 任何植物材料

4实验步骤

4.1 将测氧仪、记录仪、恒温水浴连接好，然后进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量，标定。

标定时与反应杯中加满水，放入小磁棒，调好温度，搅拌10min ，以使水中溶解的空气达饱和。将电极插入反应杯中，调节电极控制器，使极化电压为0.7V。调节移位旋钮，将记录笔调至低于满刻度（如98格），当记录为直线时，即可进行标定。

取注射器吸取新配制的饱和亚硫酸钠0.1ml，从电极塞小孔中注入反应杯中，吸去水中的氧，此时记录线逐渐下降至接近零处，如果记录线超过零或远离零，表示灵敏度过大或过小，则需要重新调节以降低或增加灵敏度，再行标定，直至合适。

测定反应杯的容积，数出记录线下降的格数，从不同温度下以空气饱和的水中氧的含量表查出实验温度下水中的溶氧量，则可以计算得到记录纸上每小格所代表的氧量（μl或nmol）

4.2 酶活性标准曲线的制作

4.2.1在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10min，插入电极，吸取溢出电极外的溶液，调节以为旋钮，使记录笔位于满刻度的10℅~20℅左右，使记录纸走动，1~2min后温度达到平衡，记录笔画出直线。

4.2.2用微量注射器从电极的小孔中注入10μl 10 U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90s内的氧释放曲线。

4.2.3根据上述步骤，诸如不同浓度的过氧化氢酶10μl，记录氧释放曲线。

4.2.4取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。 以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。 4.3 样品的测定

4.3.1在反应杯内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10min，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90s的放氧曲线。

4.3.2根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查的酶活性大小。 4.3.3如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。

4.4注意事项

植物样品可用50 mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）提取，离心之，即可用于测定。

（四）、植物组织中丙二醛含量的测定

1原理

植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（malondialdehyde, MDA）是其产物之一，通常利用它作为膜脂过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。

MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸收系数为155[mmol/(L.cm)]，并且在600nm波

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长处有最小光吸收。可按公式

A532－A600=155 000×C×L (1)

算出MDA的浓度C(μmol/L),进一步算出单位重量鲜组织中MDA的含量C(μmol/g)。式中的A532和A600分别表示532nm和600nm波长处的吸光度值。L为比色杯厚度（cm）。

C/μmol/L=6.45(A532－A600) －0.56A450 (2)

式中A450、A532、A600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值。用公式（2）可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度，进一步计算出其在植物组织中的含量。 2仪器设备

研钵，试管，可调加样器，恒温水浴锅，冷冻离心机，分光光度计。 3试剂

3.1材料：植物根或叶

3.2试剂：5﹪三氯乙酸（TCA）；0.67﹪硫代巴比妥酸（TBA）。 4.实验步骤

4.1取0.5g植物样品（叶、根），加5﹪TCA 5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min。 4.2取上清液2ml，加0.67﹪TBA 2ml，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。

4.3分别测定上清液在450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值，并按公式（2）算出MDA的浓度，再计算单位鲜量组织中的MDA含量（μmol?g-1）。 4参考文献：

5.1张志良， 瞿伟箐主编。植物生理学实验指导。高等教育出版社，2003

5.2中国科学院上海植物生理研究所等主编。现代植物生理学实验指南，科学出版社，1999 5.3朱广廉等主编，植物生理学实验，北京大学出版社，1990

7.4上海植物生理学会编。植物生理学实验手册，上海科学技术出版社，1985 7.5刘祖祺 张石城主编。植物抗性生理学。中国农业出版社，1994

7.6白宝璋 汤学军主编。植物生理学测试技术，中国科学技术出版社，1993 7.7李合生主编。植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2001 7.8薛应龙主编。植物生理学实验，高等教育出版社，1990 7.9Kochba J,et al,Plant Cell Physiol. ,1977, (18): 463~467

7.10Equeira L, Mineo L AI. Plant Physiol. ,1966, (41): 1200~1208 7.11Goldstein D B.Anal .Biochem. ,1968, (24) : 431~437

7.12Luis a . del Rio, et al . Anal. Biochem. ,1977, (80)：409~415

7.13Rorth Mikael, Jensen P K .Biophys. Acta , 1967, (139): 171~173

7.14肖萍，仲伟鉴等 。SOD的化学发光和化学比色测定法的比较 。 上海预防医学杂志， 1999， 11（2）54~55

5.推荐书目

8.1《植物生理与分子生物学学报》 中科院上海植物生理生态研究所主办 双月刊 8.2《生物工程学报》 中国科学院微生物所主办 双月刊 8.3《植物生理学通讯》 中科院上海植物生理生态研究所主办 双月刊 8.4《植物学通报》 中国科学院北京植物所主办 双月刊 6.复习思考题：

9.1植物体内除了存在抗氧化系统的酶以外还存在哪些抗氧化物质？ 9.2过氧化物酶与植物的其他代谢有何联系？

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9.3在用氧电极测定过氧化氢酶活性的实验中，为什么要用记录最初90s的放氧曲线来计算酶活性？ 7.推荐网站

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Ⅲ生物系专业系统实验（一）——植物组织培养技术实验部分

实验五 花卉组培快繁和工厂化育苗技术（18学时）

1.实验目的：

以满天星或非洲菊为材料，通过茎尖培养获得幼苗，学习花卉的组培快繁技术，熟悉工厂化育苗所需的设备条件和全过程。 2.实验要求：

学习植物组培快繁的基本操作，包括培养基的配置、分装、灭菌；外植体的清洗、消毒、剪切和接种；无菌操作间、实验台等的消毒以及无菌操作技术等。 3.实验原理：

植物细胞的全能性：植物的任何器官、组织的细胞在适宜的条件下，恢复分生功能，细胞分裂（这叫细胞脱分化）形成一种无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。在适当条件下，愈伤组织可连续多代培养（叫继代培养）。在合适的营养和激素条件下，愈伤组织细胞可重新分化而产生特定结构和功能的组织或器官（如形成芽、根或胚状体等），这叫再分化。这些都充分说明植物细胞具有与母体植株相同遗传信息的能力-------细胞的全能性。植物组织培养是在离体的情况下，创造最合适的条件，使外植体实现全能性。

许多植物的茎尖和腋芽在适宜的培养基上，在合适的激素条件下，其生长点分化形成大量芽并能实质形成良好的苗。苗经诱导可长出根而形成完整的植株，这就是茎尖组培快繁。此技术已广泛用来繁育那些不能形成种子进行繁殖或难以繁育的花卉杂交品种或其它具有重要经济价值的植物，由于病毒一般不侵入生长点细胞，因此，这种方法也广泛用来脱病毒获取脱毒苗。 4.仪器设备：

无菌操作台；高压灭菌锅；培养室；冰箱；人工气候箱电炉；微波炉；培养皿、吸水纸、解剖刀、长柄镊子等 5.试剂：

5.1 70~75%乙醇溶液；0.1%升汞溶液；20%次氯酸钠溶液； 5.2 培养基：MS+激素（MS培养基所需的各种有机、无机试剂）

诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

激素：KT、NAA、IBA、2，4—D、BA、IAA。

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