表5-2药典专论现行肼的日允许摄入量

药典 API（原料药） Ph.Eur USP Ph.Eur Ph.Eur USP Ph.Eur Ph.Eur USP Ph.Eur USP Ph.Eur USP 别嘌呤醇Allopurinol 别嘌呤醇Allopurinol 卡比多巴Carbidopa 共聚维酮Copovidone（辅料） 共聚维酮Copovidone（辅料） 硫酸二肼Dihydrazinesulphate 盐酸肼屈嗪HydralazineHCl 盐酸肼屈嗪HydralazineHCl 异烟肼Isoniazid 硫酸苯乙肼Phenelzinesulfate 聚维酮Povidone 聚维酮Povidone 限度 （ppm） 2.5 10 20 1 1 10 10 10 125 1000 1 1 最大日剂量 肼摄入量 （mg/天） （μg/天） 800 800 200 / / 200 200 200 300 90 1500 1500 2.0 8.0 4.0 / / 2.0 2.0 2.0 37.5 90 1.5 1.5 通过允许的限度，推算出允许的暴露量，这样了解当前官方对肼物质的监控暴露水平。其中异烟肼与硫酸苯乙肼中的肼杂质属于例外，其结构与原料药结构相关，限度远远地高于TTC(毒理学关注阈值)的1.5微克/天。药典当前实际正常控制肼杂质的日允许摄入量接近或略高于TTC（毒理学关注阈值）。

5.3分析检测方法

遗传毒性杂质通常是化学反应产生的，因此，如果这些因素不能通过采用替代的合成路线来消除，就应该集中精力来将杂质降低到TTC（毒理学关注阈值）的水平，或者达到一个切合实际的水平。在临床试验阶段，有许多的临床实验参与者，许多种类的病人和适应症，变动因素较多，这里所论述的可接受水平是基于成熟的工艺，并有可以采用的分析方法。但在研发早期，分析方法的灵敏度受到挑战的因素主要来自于杂质的控制限度低和合成工艺的稳健性。另外对药品中杂质残留检测考察，还受到合成反应步骤及所采用原料和试剂数量的影响。要想实现对杂质的检测与控制，需要具备专属性好和灵敏高的分析方法，通常需要获得杂质对照品，所以新药研发阶段在时间、资源、成本之间的均衡显得尤为重要，需要保证所做的努力侧重在对病人有安全风险的杂质上。

有许多公布的方法来描述分析检测药品中的遗传毒性杂质。在工艺研发的早期，最好就能具备一个检测遗传毒性杂质的分析方法，作为工艺人员了解评估产品中遗

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传毒性杂质的工具，后期可以进行微调来改善灵敏度和耐用性。有两种出色的方式来对待遗传毒性的烷基化试剂已经发布[9,10]。第一，除了通常的已经报道的高效液相色谱（HPLC），气相色谱（GC）等方法，每日总的给药剂量较小的药品，可接受限度会相对高一些，药典收录的专属性和灵敏度稍差的薄层色谱（TLC）方法也可能可以满足要求并简便可行；第二，遗传毒性杂质的控制，首先是要基于安全和风险来考虑，如果不能从工艺上去避免，只要控制在风险工具TTC（毒理学关注阈值）允许的限度内即可（第一类遗传毒性高度关注杂质除外）。并不是针对所有的遗传毒性杂质都必须采用最精确灵敏的分析检测设备和卓越的工艺能力使其达到尽可能低的限度。遗传毒性风险的杂质包含了大量的化合物，在所有分析方法中，目标都是尽量让被分析物灵敏并从基质干扰中分离出来，这类方式在肼杂质研究过程中也可以参考。

作为肼杂质，由于肼结构本身没有紫外活性，需要采用衍生化的方法，才能进行定量或者限度的检测。薄层色谱（TLC）主要采用苯甲醛衍生，高效液相色谱（HPLC）采用苯甲醛衍生，由于薄层色谱（TLC）的准确度和专属性受到限制，欧洲药典委员会（EDQM）从2006 年就大力推进在成品放行检测时，推荐采用高效液相（HPLC）替代薄层色谱（TLC）进行杂质的控制，薄层色谱（TLC）已经有逐步被高效液相 （HPLC）方法取代的趋势，针对肼杂质，高效液相（HPLC）方法已经是相对较为理想的控制方法。

表5-3现有药典方法控制肼的限度

API（原料药） 别嘌呤醇Allopurinol 别嘌呤醇Allopurinol 卡比多巴Carbidopa 共聚维酮Copovidone 共聚维酮Copovidone 硫酸二肼Dihydrazinesulphate 盐酸肼屈嗪Hydralazine Hydrochloride 盐酸肼屈嗪Hydralazine Hydrochloride 异烟肼Isoniazid 硫酸苯乙肼Phenelzinesulfate 聚维酮Povidone 聚维酮Povidone 肼残留分析方法 HPLC--苯甲醛衍生物 HPLC--苯甲醛衍生物 TLC--水杨醛衍射物 TLC--水杨醛衍射物 TLC--水杨醛衍射物 HPLC--苯甲醛衍生物 TLC--水杨醛衍射物 HPLC--苯甲醛衍生物 TLC--二甲氨基苯甲醛 HPLC--水杨醛衍射物 TLC--水杨醛衍射物 TLC--水杨醛衍射物 限度方法/定量方法 定量方法 定量方法 限度方法 限度方法 限度方法 定量方法 限度方法 定量方法 限度方法 定量方法 限度方法 限度方法

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在考虑杂质的检测方法时，首先需要尽量掌握杂质的一些性质，肼有强的极性，基本的结构会受到许多分析方面的挑战，它们缺少能被紫外检测到的基团。没有取代基的肼物质没有包含碳，不适合用火焰离子检测器（FID）进行检测。肼具有低的分子量能够用质谱进行检测，但来自其它物质的干扰可能是一个问题，尤其是痕量水平的分析。因为肼十分活泼，能够采用衍生化的方法[11,12]。衍生法不仅增加了基团结构，而且增加了分子量能够提高火焰离子检测器（FID）检测的灵敏度[11]。尽管直接检测肼存在挑战，还是有报道了两种分别采用离子色谱（IC）和亲水色谱柱 （HILIC）技术，不需要衍生直接检测肼的方法[12]。

Khuhawar[13]开发了一种气相方法来检测异烟肼制剂（糖浆和片剂）中的肼，该方法采用火焰离子检测器（FID）和氯甲酸乙酯衍生试剂。肼是异烟肼的一种降解物，这种方法被用来检测制剂，包括片剂。针对片剂样品的制备，需要在衍生前和衍生后采用氯仿进行提取，这样可以将肼与片剂中的其它成分分离。没有提取的步骤，片剂的部分异烟肼成分进样到气相色谱中，可能发生降解，产生不稳的基线。这一方法的检测限(LOD)是1.75 μg/mL，在3.5-35 μg/mL的范围内，线性回归系数大于>0.9958。相对偏差在1%到2%，非常低。

火焰离子检测器（FID）检测器是常见的检测手段，但可能不够敏度。Carlin[14]开发了高灵敏度的直接进样的气相/电子捕捉检测器（GC/ECD）方法来检测异烟肼制剂中的肼。在GC分析之前，肼被采用两分子的苯甲醛进行衍生。肼的定量限(LOQ)是1μg/mL，相当于10ppm（异烟肼浓度10mg/mL），在0.1-1μg/mL的范围内，线性回归系数为0.998，偏差在9.5%到11.3%。以前选择电子捕捉检测器（ECD）来替代火焰离子检测器（FID），往往出于配方改变需改善专属性而不是改善灵敏度。

Sun[12]开发了一种通用的顶空气相质谱联用（GC/MS）方法来检测原料药中的肼杂质，该方法有与气相/电子捕捉检测器（GC/ECD）相近的灵敏度。样品采用丙酮衍生来形成丙酮连氮。然而，丙酮将在顶空中与更高沸点的丙酮连氮形成竞争，造成灵敏度和重复性的问题。如果需要采用需要进一步的优化衍生溶液。

还有一种气相衍生的方法就是直接采用离子色谱（IC），Jagota[15]开发了一种直接进样离子色谱（IC）电化学检测方法来检测一个抗感染制剂倒数第二步中间体中的肼。这个方法引入了少量的样品溶液，不需要很费时间的衍生步骤。方法简化之处在于，样品溶解在50/50 的甲醇/水（v/v）中，并且立即进行离子色谱（IC）进样。

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只需要运行10分钟。定量限（LOQ）是100ppm，相对于0.5mg/mL的中间体溶液浓度。在100ppm到400ppm的范围内，线性相关系数大于0.99。精密度在100ppm 是1.2%，100ppm到300ppm，回收率为90.2-104.9%。

在前面的离子色谱（IC）方法上，亲水色谱(HILIC)分析方法不需要衍生。Liu报道了一种新的亲水色谱柱(HILIC)/化学发光氮检测器（CLND）方法同时来检测医药中间体中的肼和1,1-二甲基肼[16]。这个方法新颖之处在于同时检测有取代基的肼物质，与报道过的文献是不一样的。亲水色谱柱(HILIC)将肼这样的极性分子分开是理想的。这种情况下，繁琐的衍生方法是没有必要的，肼可以以它们本身的结构被检测。采用亲水色谱柱(HILIC)的分离机理，更少极性的物质被包括在水性的流动相中来控制极性物质从固定相上的洗脱。一种由醇组成的流动相被研究和最终采用来使样品溶液与化学发光氮检测器（CLND）匹配（缺少含氮流动组分），多种醇被筛选来优化肼的出峰时间和分离度，最后为了合适的分离度和运行时间，选择了分离效果适中的乙醇。

图5.1:在亲水色谱(HILIC)流动相中不同的醇对肼的分离效果

(1=1,2-二甲基肼, 2= 1,1-二甲基肼, 3 =甲基肼和4 =肼)

增长的醇链长度与肼的保留时间符合，与醇和被分析物在固定相的水相层的分布影响和氢键竞争有关。相对于10mg/mL的样品检测溶液，肼和1,1-二甲基肼的定量限（LOQ）为0.02%，在0.01%到0.1%的浓度范围内，线性回归系数大于0.999，在0.02%的水平，检测肼和1,1-二甲基肼的精密度分别为5.0%和3.9%。肼在定量限 （LOQ）的回收率为80.0-87.8%；1,1-二甲基肼的回收率为99.4-102.5%。这个方法

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