的对应限度关系，列入下面的表3.1。

表3.1-分层级TTC,日剂量以及遗传毒性杂质限度之间的关系

给药期限 日摄入量 基于日剂量的杂质限度（ppm） （月） （μg/天） 1mg 2.5mg 5mg 10mg 50mg 0.1g 0.2g 0.5g 1.0g 2.0g >12 ≤12 ≤6 ≤3 ≤1 ≤14 1.5 5 10 20 60 120 1500 5000 5000 5000 5000 5000 600 2000 4000 5000 5000 5000 300 1000 150 500 30 100 200 400 1200 15 50 100 200 600 7.5 25 50 100 300 3 10 20 40 120 240 1.5 5 10 20 60 120 0.75 2.5 5 10 30 60 2000 1000 4000 2000 5000 5000 5000 5000 2400 1200 600 从换算来的表格中的数据可以看出，针对毒性异常的杂质，长期和剂量较高的情况下，很多限度要求都低于了ICH Q3A所要求进行安全性评估的限度1500ppm。ICH 指南Q3A不能充分地覆盖这些情况，这就是TTC 风险工具所要进行控制的。

最近，ICH发布的M7 指南草案，基于Haber理论，即毒物学的基本理论：浓度 （c）与时间（t）的乘积是一个常数（k），也给出了不同给药期限下的允许暴露量，将为临床实验和不同的给药期限提供了一个参考的限度，不仅考虑了单个遗传毒性杂质，对总遗传毒性杂质的限度也提出了要求，列出见下面的表3.2，ICH 指南M7草案对短期用药的情况进行了微调，并予以补充和完善，将来推广后，将为新药临床实验或短期用药参考，也为同时出现多个遗传毒性杂质的情况提供了参考依据。

表3.2不同给药期限下单个遗传毒性杂质TTC和总遗传毒性杂质TTC的关系

给药期限 不长于1 个月 1 个月到12 个月 1年到10年 10 年以上 单个遗传毒性杂质日 120 20 10 1.5 摄入量（μg/天） 总遗传毒性杂质日摄 10（30*） 120 60 5 入量（μg/天） *临床研究3年以上，相似的原则在论证的情况下可能可以应用到市售的药品。

表3.2 明确给出了官方现阶段的想法，在合理论证后，比TTC（毒理学关注阈值）更高的限度也是可以接受的，比如短期治疗用药，用于威胁生命的疾病的治疗，晚期疾病的治疗。

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第4章杂质结构评估与归类

4.1杂质结构毒性风险归类

依据图3.1 的基本流程，实际评估过程中主要包括杂质的识别、分类、限度论证、生产工艺控制及成品检测的内容，主要的步骤如下：1）工艺人员评估合成路线来识别具有警示结构的化合物，清单包括起始物料、中间体、试剂、明显的副产物，初步简单地寻找警示结构，不是进行分子结构--毒性相关性评估。2）工艺人员和分析人员修改最初的清单，基于工艺评估该杂质被带入药品中的可能性，并结合具体的分析检测数据。3）毒性研究人员针对重点化合物进行分子结构-毒性相关性安全评估，针对已知的、理论上可能出现的潜在遗传毒性杂质，依据参考文献或毒性实验数据，进行归类来设定限度。4）根据多批评估结果和工艺具体情况来判断带入成品中的可能性大小，确定检测控制策略。

当工艺人员确定生产工艺中出现警示结构时，需要多方参与对比判断评估。例如，若出现肼结构杂质，首先工艺人员需确认是否有可替代的合成路线来避免这类物质。再基于文献或实验数据的结果，来确定这类杂质的可接受限度，进一步从工艺反应机理和分析检测评估两方面来组织对这类杂质出现在成品中的可能性进行评估，确定合适的控制策略。

从工艺上分析在原料药中出现的可能性，比如一个遗传毒性肼结构的起始物料在五步反应的第一步用到，不太可能带入原料药中，但也需要检测评估证实。另外遗传毒性物质也可能在后续的步骤被破坏或者去除。需要分析数据来证实遗传毒性杂质在最后产物中出现的可能性。但由于现有的分析方法，尤其是早期的实验方法的灵敏度，可能不足以灵敏精确地检测到TTC（毒理学关注阈值）水平以下的杂质，分析人员研发相应的实验分析方法所作的努力十分重要。评估是否具有警示结构，药品研发过程中，需要借助数据库NTP（NationalToxicologyProgram）所收录的警示结构或者相应的计算机辅助软件来评估确定。

在NTP所收录的警示结构库中，肼结构的杂质已经列为警示结构，遗传毒性杂质的毒理学评估和这些杂质在活性药物中的可接受标准的确定是一件困难的事情，在现有的ICH指南Q3A~C中也没有详细的规定。遗传毒性物质在任何摄入量都对DNA有潜在破坏性，这样的破坏也有可能会导致产生肿瘤的相关变异。然而，对于遗传毒性的致癌物，“不存在明显的阀值，或者说在任何摄入量的水平都有致癌风

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险”的说法不能接受。生物学上重要的“阀值理论”也可以应用在遗传毒性的研究上，这观点已经正在被逐渐的认可，并被USFDA、EMA和ICH的遗传毒性相关指南文件所采用。有的化合物，比如叠氮钠、水合肼，它们可与非DNA靶点进行结合反应，或者说有一些可能致突变的物质，比如亚硝酸盐，在与关键靶位结合之前就已经迅速地失去了毒性，对这种性质的化合物，可以鉴定其NOEL（No-observed-effect level, 不可观察到效果的最低水平）和UF（Uncertaintyfactors,不确定因子）来推算允许的安全的摄入量。对于那些可能直接与DNA结合反应的物质，比如一些烷基化试剂，按摄入量由高到低所造成的影响程度（潜在可能的导致肿瘤的活性）进行线性推断是很困难的，因为在较低的摄入量时，宿主细胞自身基因免受损害的修复机制可以有效的运行。对于一个特定的诱变剂，很难从实验方面证明它的遗传毒性存在一个阀值。由于缺乏支持遗传毒性阀值存在的有力证据，而使得我们很难界定一个安全的服用量，所以有必要采取前面提到的一个新观点：使用了从一个半数致癌剂量（TD50）到百万分之一的致癌剂量的线性推理，确定一个可接受其风险的摄入量TTC 来作为风险控制工具。

尽管ICH 指南Q3A（R）和Q3B（R）指出，检测限度之下的杂质不需要鉴别，但应该为那些效力异常，在检测限度之下也有可能产生毒性或药理学作用的潜在杂质开发分析方法，其目的是为了控制这些毒性异常杂质的风险。指南推荐从整个合成路线来评估，包括化学反应和条件，识别试剂、中间体、起始物料和可以预知的潜在副产物。识别出这些潜在遗传毒性杂质后，就由专业人员针对列出的物质，采用计算机辅助工具比如QSAR或知识库专家系统进行遗传毒性初步评估。也可通过文献和内部档案检索来完成，因为一些中间体和试剂在其他的药物研发中已经被当成遗传毒性杂质进行实验，实验数据比计算机预测的要可信，化合物的理化性质以及在人体内表现出的活性，直接由化合物的结构所决定，因此依据杂质的结构，可以将杂质遗传毒性的大小实行归类。这与行业现行的通过毒性风险大小将有机溶剂分为四类，将重金属分为三类的做法是相类似的，都是将受高度关注毒性最大的物质归为第一类。原料药中的杂质，包括肼类杂质，都可以根据现有的信息，归为五类中的某一类。目的是为了将风险进行分级而采取不同的控制策略。五种类型的杂质以及可能的对待方式已经有学者归纳总结过[8]，列出详见下面的表4-1。

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表4-1 杂质遗传毒性评估结构分类

类别 结构特征 第一类 具有遗传毒性和致癌性，这 类杂质包括已知的可使动 物致癌的物质，具有足够的 关于遗传毒性和人类致癌 的数据。如：氧化偶氮基化 合物，N-亚硝基化合物。 第二类 具有遗传毒性，但致癌作用 尚未知的杂质，包括那些在 可靠的遗传毒性实验中呈 阳性，但致癌作用未知的杂 质。肼结构杂质评估后归为 该类。 第三类 具有警示结构，与原料药的 结构不相关，不确定是否具 有遗传毒性或致癌作用。 第四类 警示结构，与原料药本身相 关，这类杂质包括有与原料 药共有的结构。 第五类 无化学结构警示或有充分 的数据证明无遗传毒性。 可能的对待方式 最好的选择是通过改变合成路线，改变起始 物料或增加去除步骤来避免药品中出现这类 杂质，尽管在几乎已经优化的工艺上做根本 的改变是不可行的，规格中通常应该予以检 测。当获得足够两年的啮齿类动物毒性实验 数据时，能够进行化合物特定的风险计算。 TD50（半数中毒量）或者MTD（最大耐受 剂量）能够被用来计算最大的日摄入量。 应该评估它是否表现出有一个动物实验阈 值。如果不与DNA直接作用，人体允许暴露 限度能够通过确定NOEL(不可观察到效果的 最低水平)或者LOEL(可观察到效果的最低 水平)的值来确定。当杂质与DNA 直接作用 （比如，DNA加合物形成或与DNA结合）， 它们的限度将采用TTC（毒理学关注阈值） 来进行控制。 这类杂质含有警示结构，却没有试验数据。 一个第三类杂质可能会需要采取下面的措 施：(1)通过Ames试验来测试单独分离的杂 质，或通过在原料药中加入杂质，对混合物 进行Ames试验；进一步进行归类，阳性结 果归为第二类，阴性结果归为第五类。(2)有 效检测API 中杂质到ppm的水平；(3)如果可 能，提供化学上的分析来证明杂质不会被带 入到原料药中（比如，在接下来的反应条件 下不稳定而降解）。 虽然杂质本身的遗传毒性未知，原料药的遗 传毒性已经系统地研究过，因此不需要针对 杂质进行这方面的研究。 作为常规杂质，参照ICH Q3A进行控制 以上五类杂质，第一类需要特殊对待除外，其它四类会根据对风险的认识程度与遗传毒性风险的大小，表述成如下的决策树，视情况可以进一步分为三种方式进行限度的论证，不同种类的结构经过一系列评估确认之后，根据其毒性风险的大小，采用三种方式评估确定不同的可接受限度。

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