10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

图1 菌悬液稀释示意图

Figure 1 Schematic diluted bacterial suspension

（6）用移液器取每种菌的每种浓度（从10-2至10-6）的稀释液1mL放于每一平板中，并做好标记，每种菌的每种浓度的稀释液有两个平板做平行试验，将适宜温度的培养基倒入平板中（每个平板约15mL）；

（7）将上述20个平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h；

3.2测量每种抗生素最小抑制细菌浓度MIC

（1）按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方配制培养基400mL,并分装在锥形瓶中，进行包扎灭菌；

（2）配制适量生理盐水与锥形瓶中进行包扎灭菌；

（3）将三种抗生素原液进行二倍稀释，以0.9%无菌生理盐水为稀释液，得100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL稀释液；

（4）取出扩繁的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各一支，向其中加入温度适宜的生理盐水（约5mL）；

（5）将灭过菌培养基倒入平板中（每个平板大约15mL），吸取每种菌种的菌悬液200μL于每个平板中（每种菌有九个平板），用涂布棒进行涂布接种；

（6）在无菌环境下，用移液器吸取30μL稀释好的各浓度的抗生素溶液湿润滤纸片（2层滤纸片叠在一起），将滤纸片贴在含有待检测菌种平板上，不同浓度的同一种抗生素贴在一个平板上，每种抗生素再做两组平行试验，平板中间贴上对照组（生理盐水），故一个平板上贴6个滤纸片（5+1），做上标记；

（7）将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h；

（8）观察记录前一天实验的抑菌圈的大小，以出现的最小抑菌圈（7.0mm）的浓度作为MIC，如果未出现7.0mm 的抑菌圈则将抗生素的最小稀释浓度继续稀释，重复以上七步，并进行观察，以至于得到各种抗生素的最小抑制浓度；

3.3测定每种抗生素对每种菌的作用效果（表现为抑制或者杀灭）

（1）将抑菌圈大小合适的一组平板的滤纸片接下，并放入37℃恒温培养箱中培养24h； （2）观察实验结果，若原抑菌圈中出现新的菌落则说明该抗生素对该菌的作用效果为

抑制作用，若原抑菌圈中未出现新的菌落组说明该抗生素对该菌的作用效果为杀灭作用；

3.4测定一种抗生素的最适pH

（1）pH选5、6、7、8、9进行最适pH的选取；

（2）选用抑菌效果最好的抗生素卡那霉素，将抗生素的的pH分别调至5、6、7、8、9五个点；

（3）倒3个平板，用涂布法接种枯草芽孢杆菌3个平板；

（4）在无菌环境下，用移液器吸取30μL抗生素溶液湿润滤纸片（2层滤纸片叠在一起），将滤纸片贴在含有待检测菌种平板上，每种浓度抗生素贴在同一个平板上，平板中间贴上对照组（生理盐水），故一个平板上贴6个滤纸片（5+1），做上标记，再做两组平行试验；

（5）将上述的3个平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h。

3.5将所有的实验结果做图像采集

四、实验结果

4.1倾注法接种测菌悬液浓度的结果见下图和下表

4.1.1测菌悬液浓度的平板结果见下图

图2 测量菌悬液浓度的平板

Figure 2 tablet measuring the concentration of the bacterial suspension

通过观察平板菌落的形成情况得到，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌稀释液为10-2和10-3因浓度太大无法进行计数，对其余平板上的菌落进行计数并进行数据的记录。 4.1.2各浓度接种液菌落的计数结果见下表

表2 测定菌悬液浓度的结果

Table 2 The results of measuring the concentration of the bacterial suspension

大肠杆菌

菌种

A

10-2 10-3 10-4 10 10 两个稀释度菌

4.8

落数之比 菌落总数/ （CFU/mL） 平均数/ （CFU/mL）

7

-6-5

枯草芽孢杆菌

B

A 无法计数 无法计数 328 68 561 -

B 无法计数 无法计数 381 74 11 -

无法计数 无法计数 1463 66 32

无法计数 无法计数 无法计数 206 64 3.1

6.6?106 2.1?107 6.8?106 7.4?106

1.3?10

7.1?106

7

根据检测平板的菌落技术方法得到结果，大肠杆菌菌悬液浓度为1.3?10 CFU/mL，枯草芽孢杆菌菌悬液浓度为7.1?106 CFU/mL。

4.2测定每种抗生素对每种细菌的最小抑制浓度MIC结果见下图和下表

4.2.1第一次实验所得抗生素对细菌的抑菌圈见下图

图3 第一次实验所得每种抗生素对每种菌的MIC

Figure 3 for the first time each of the experimental antibiotic MIC for each strain 注：卡那霉素、四环素、青霉素1,2,3,4,5号浓度（mg/mL）分别为100、50、25、12.5、6.25

观察平板中每种抗生素对每种菌的抑菌圈大小，虽然由于滤纸片上的抗生素溶液没有晾干就贴在平板上，导致抗生素溶液到处流淌，并且抗生素的浓度太大，所产生的抑菌圈连在一起，无法准确测量抑菌圈大小的准确数值，但通过观察，依然可以得到，5号滤纸片上的抗生素浓度（6.25mg/mL）依然很大，需继续对抗生素进行稀释才能得到每种抗生素的最小抑制浓度。

通过仔细观察，本组成员观察到大肠杆菌对青霉素出现抗性，见下图

图4 大肠杆菌对青霉素出现抗性

Figure 4 appears resistant to penicillin E.coli

4.2.2第二次实验继续稀释抗生素所得抑菌圈大小统计见下图和下表 （1）继续稀释抗生素所得抑菌圈大小见下图