实验五、细胞骨架的显微结构标本制备和观察

一、

目的和要求

1、 掌握细胞骨架光镜标本的制备方法。

2、 掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架的染色方法。 3、 了解植物细胞骨架的基本形态和结构。 二、

实验原理

细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据组成成分和形态结构的不同，分为微丝、微管和中间纤维，它们对细胞形态的维持，细胞生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，基因表达等起到重要作用。

对光镜下细胞骨架的显微结构观察采用的方法是1%或2%TritionX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，可将质膜中的和细胞基质的蛋白质及全部脂质溶解，使大部分的可溶性蛋白质及全部脂质被抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，再用考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到清晰的微丝束，网状结构，即为细胞骨架。

三、

器材和试剂

1、器材：显微镜1台、恒温箱1台、50ml小烧杯、吸管、小镊子、剪刀、

载玻片、吸水卷纸、擦镜纸、水果刀、5ml 移液枪、洗耳球。 2、试剂配制

a、6m mol/L磷酸缓冲液（PH6.5）：配1000ml.

b、M-缓冲液：（咪唑3.40g、KCL3.7g、Mgcl2 .6H2O、EGTA 0.38g、EDTA 0.02g

巯基乙醇0.07mol、甘油292ml、溶解后用蒸馏水定容到1000ml，再用1mol/L的HCL调至PH7.2，温室保存）。

c、2%TritionX-100液：10mlTritionX-10加M-缓冲液500ml。

d、3%戊二醛：取25%戊二醛原液30ml，加磷酸缓冲液（PH7.2）264ml。 e、0.2%考马斯亮蓝R250染色液100ml。 f、单蒸水1000ml。

四、内容和方法

1、取材：切开洋葱鳞茎，撕开中层鳞片的内表皮，剪成2-3mm大小的小片，浸入装有6m mol/L PBS（PH6.5）的小烧杯中，使其下沉，处理5-10min。

2、抽提：用吸管吸取PBS缓冲液，加5ml 2%TritionX-100入小烧杯中，置37oC恒温水浴箱中处理25min（期间轻微摇动），以提取细胞骨架以外的蛋白质。

3、冲洗：用吸管吸去2%TritionX-100液，加入5ml M-缓冲液轻轻洗3次，每次5min,以使细胞骨架稳定。

4、固定：吸去M-缓冲液，加入5ml 3%戊二醛固定液，固定15min。 5、冲洗：吸去固定液，加入5ml 6m mol/L PBS(PH6.5)液洗3次，每次5min。 6、染色：吸去6m mol/L PBS(PH6.5)液，滴加10滴0.2%考马斯亮蓝R250染色液染色10min。

7、制片：吸去染色液，用蒸馏水洗2-3次，每次2min，将标本取出平铺在载玻片上，盖上盖玻片即可进行观察。

五、注意事项

1、细胞骨架观察中戊二醛的作用？

答：为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛

是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构，故本实验用戊二醛进行固定，而不用75%的乙醇固定。

2、关于“细胞骨架观察实验中磷酸缓冲液和M-缓冲液的作用？

答：磷酸缓冲液中含有生理盐水，可使细胞不被破坏，能保持原有状态下的

结构。M-缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定，在M-缓冲液中，其中咪咪结合缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子，M-缓冲液同时提供Mg离子，在低钙条件下，可以提高细胞骨架的稳定性，骨架纤维保持聚合状态，并且较为舒张，便于观察。

六、作业

对实验结果细胞骨架的基本形态进行拍照，阅读课本内容，理解细胞骨架的组成及其功能。

洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（40x10）

图中颜色较深圆状的是细胞核，染色较浅有层次则为细胞骨架。

1、微丝的功能是使细胞收缩和进行物质运输，微丝的组装/去组装与多种细胞生命活动有关，确定细胞表面特征。

2、微管的功能：对细胞结构其组织作用，微管起物质运输作用和帮助染色体分离。

3、中间丝的功能：使细胞具有张力和抗剪切力。

实验结果分析：细胞核中的蛋白质含量较高，故被染成颜色较深的圆点。由图可得，细胞骨架由细胞内部向外的含量递减，由颜色深浅判断。由于染色时间不够或蒸馏水洗的时间过长，使得制片的着色部分为紫色而不是蓝色。细胞中带有颜色较深的点，而未能清晰看到微丝束，我觉得是抽提时，没有除尽细胞骨架以外的蛋白质（原因，抽提时没有轻微摇动）。