类型Ⅱ酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。类型Ⅱ酶的识别序列常为4—6bp的回文序列。甲基化酶能使半甲基化DNA，识别位点上特定碱基甲基化，甲基化酶每次作用只引入一个甲基。DNA两条链都已甲基化时无反应，两条链都末甲基化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内，或靠近识别位点。切割DNA或是将两条链对应酯键切开，形成平末端，或是将两条链交错切开，形成单链突出的末端。切开的两末端单链彼此互补，可以配对，故称为黏性末端。由不同微生物分离得到的限制酶。如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶。如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶。③类型Ⅲ酶为两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割，其修饰与切割都需要ATP提供能量，切割位点在识别位点下游24～26bp处。

3.DNA物理图谱

在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。限制酶图谱的制作十分简单。 将纯化的DNA(往往用分子克隆法，从单一克隆中扩增而制备)，用不同的限制酶切割，进行凝胶电泳分析。根据测量凝胶电泳图上各酶切片段的长度，就可以决定各切点的位置。

4.分子杂交

在DNA复性时，如把不同DNA分子或DNA与RNA分子放在同一溶液中，只要这些核酸单链分子之间存在一定程度的碱基配对关系，就可在不同分子间形成杂化双链，这种现象称核酸分子杂交。

（1）Southern blotting 将限制性内切酶酶切电泳后的DNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和基因定位。

（2）Northern blotting 将电泳后的RNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。研究对象是RNA。 （3）Western blotting 将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质转移至NC膜上，再与另一标记蛋白质分子(如抗体)杂交的技术。抗原与抗体的杂交，研究基因表达产物的常用技术。

5.DNA序列分析

（1）化学法 化学法的原理是用特异的化学试剂修饰DNA 分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链。所以，用四组不同的特异反应，就可以将末端(3’或5’ 端)用放射性标记的DNA分子形成不同长度的寡核苷酸。用凝胶电泳将这些不同长度的寡核苷酸分离开来，即可读出所测定的DNA的序列。

（2）双脱氧法(dideoxy method)也称酶法(enzyme method)，是由Sanger于1977年建立的。其原理是利用2’，3’-双脱氧三磷酸核苷(2’，3’-ddNTP)来终止DNA的复制反应。大肠杆菌DNA聚合酶(或K1enow片段)在DNA复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸是接在延伸链的3’-0H上。所以，如果掺入的底物中有2’，3’-ddNTP，延伸反应即告终止。这样设计四组反应，每组反应中都含有正常的四种脱氧核苷酸dNTP(其中一种为P标记的)，单链DNA模板(即待测的DNA)和引物(Primer)，各组反应还加入一种2’，3’-ddNlP。反应结果，在加入2’，3’-ddATP的反应中，凡碰到需要dATP的时候，如果掺入的不是dATP，而是2’，3’-ddATP时，链延伸反应即告终止。用凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影上读出DNA的序列。

（3）RNA的序列分析 ①酶裂解法，从胰脏提取的Rnase A水解嘧啶核苷酸的键，所产生寡核苷酸的3’端均为嘧啶核苷酸。米曲霉中提取的RNase Tl特异水解鸟苷酸与相邻核苷酸的键。黑粉菌中提取的RNase U2在一定条件下特

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异水解腺苷酸的键。从多头粘菌中提取的RNase Phy I水解A、G、U 3种核苷酸，但不水解胞苷酸。利用上述4种酶可测定RNA的序列。②用化学试剂裂解RNA 基本原理与DNA化学测序法相似。③逆转录成cDNA 即可用DNA测序法来测定序列。

6.DNA的化学合成

DNA的化学合成已有自动化仪器来完成，目前采用的是亚磷酸三酯法。 7.DNA聚合酶链式反应

DNA的聚合酶铤反应(PCR)是一种快速简便的体外DNA扩增技术，能在很短时间内，将几个拷贝的DNA放大上百万倍。是应用最广泛的生物技术。

（1）它的基本步骤为：①设计一对引物。②优化反应体系。③选择热循环温度。④鉴定扩增产物。

（2）工作原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，使目的DNA片段得到大量扩增。

（3）用途 目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA微量分析等。

三、重点、难点

重点：本章应重点掌握核酸的分子组成、核酸的分子结构、特别是DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA的变性、复性及杂交的概念及意义。为基因信息的传递各章节的学习打好基础。还应该了解核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶及DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA聚合酶链式反应（PCR）等现代的核酸研究技术。

难点：DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA序列分析和DNA聚合酶链式反应（PCR）。

第6章 维生素与辅酶

一、教学大纲基本要求

4种脂溶性维生维生素即：维生素A与胡萝卜素，维生素D，维生素E和维生素K;10种水溶性维生素及其辅酶即：维生素B1，维生素B2，维生素B3，维生素B5，维生素B6，维生素B7，维生素B11，维生素B12，硫辛酸和维生素C。

二、本章知识要点

(一) 维生素(Vitamin)的概念

1．维生素(Vitamin)的概念: 维生素是维持机体正常代谢和健康所必需的，但体内不能合成或合成量不足，必须靠食物供给的一类小分子有机化合物。

2．维生素的分类: 根据维生素溶解的性质可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。(1)脂溶性维生素(Lipid-Soluble Vitamin)包括维生素A、D、E、K。(2)水溶性维生素(Water-Soluble Vitamin)包括B族维生素和维生素C，B族维生素又包括维生素B1、B2、PP、B6、泛酸、生物素、叶酸、B12等。

3．维生素缺乏原因: (1)摄入量不足。(2)吸收障碍。(3)需要量增加。(4)长期服用某些药物。 （二）脂溶性维生素

脂溶性维生素的特点：都是亲脂性的非极性分子或者衍生物，可伴随脂类吸收(可大量在体内储存)若吸收障碍就易产生缺乏病。此类维生素各自发挥不同的生理功用。

l. 维生素A

(1)化学本质与性质：维生素A是β—白芷酮环的不饱和一元醇。化学性质活泼，对氧、酸及紫外线敏感。在避氧情况下可耐高温。

(2)维生素A原及转变：自然界一些红黄色植物(如胡萝卜素、红辣椒、黄玉米、茄等) 含有类胡萝卜素。

(3)生化作用及缺乏症：①11—顺视黄醛构成视角细胞内感受弱光或暗光的物质——视

紫红质。②参与糖蛋白的合成，维持上皮细胞的完整与健全。③β胡萝卜素是抗氧化剂，在氧分压低时直接消灭自由基。④维生素A具有类固醇样作用，促进生长发育。⑤维生素A缺乏时可导致夜盲症，干眼病．角膜软化症等。

2．维生素D

(1)化学本质与性质：维生素D属于类固醇的衍生物，主要有VD2(麦角钙化醇，)和VD3(胆钙化醇，)两种。 (2)维生素D在体内转变：维生素D在血液中与维生素D，结合蛋白(DBP)结合，被运输入肝。维生素D3本身无活性。在肝细胞微粒体25-羟化酶催化下转变为25-OH-VD3，它是D3在血液中运输和肝内储存形式。后经肾线粒体10-羟化酶作用生成1，25-(OH)2-VD3，是D3生理活性形式。

(3)生化作用及缺乏症：l，25-(OH)2-D3促进小肠对钙磷的吸收，促进肾小管钙磷的重吸收，调节钙磷代谢。维生素D缺乏时，儿童可发生佝偻病，成人易发生骨软化病。

3．维生素E

(1)化学本质及性质：维生素E为二氢吡喃的衍生物，又称生育酚。分α、β和γ几种。α—生育酚分布广，活性高，对氧极敏感，易自身氧化。故可保护其他物质。

(2)生化作用及缺乏症：①维生素E与动物的生殖功能有关。临床上常用维生素E治疗先兆流产和习惯性流产。②维生素E是体内最重要的抗氧化剂，可捕捉氧自由基。③促血红素代谢：维生素E提高血红素合成关键酶δ—氨基γ—酮戊酸(ALA)合成酶及ALA脱水酶活性，促进血红素的合成。

4．维生素K

(1)化学本质及性质：维生素K是2—甲基1，4－萘醌的衍生物，又称凝血维生素。常见的维生素有K1、K2两种。K1存在绿色植物中。 K2是人体肠道细菌代谢的产物，不溶于水，易受光线和碱的破坏。K3、K4是人工合成，溶于水可口服或注射。

(2)生化作用及缺乏症：维生素K能促进肝合成凝血酶原(凝血因子Ⅱ)及凝血因子Ⅶ、Ⅸ和X。维持体内凝血因子在正常水平。成人每日需要量为60～80μg缺乏时血液中凝血因子活性降低，凝伞时间延长。严重时发生皮下，肌肉和胃肠出血。 （三）水溶性维生素

1．维生素B1

(1) 化学本质及性质：维生素B1是含硫的噻唑环和含氨基的嘧啶环组成，又称为硫胺素。 维生素Bl吸收后主要在肝及脑组织转变成焦磷酸硫胺素(TPP)。TPP是维生素B1在体内的活性形式。

(2)生化作用及缺乏症：①TPP是α—酮酸氧化脱羧酶的辅酶，催化α—铜酸氧化脱羧。②TPP作为转酮醇酶的辅酶，参与磷酸戊糖代谢。③TPP与神经冲动传导有关。④维生素B1缺乏时，可引起脚气病和末梢神经炎。成人需要量为1～1.5mg／每日。

2．维生素B2

(1)化学本质：维生素B2又称核黄素，是核醇与7．8二甲基异咯嗪以C—N键连接而成，维生素B2吸收后在体内转变成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，FMN、FAD为其活性形式。

(2)生化作用及缺乏症：FMN、FAD是体内许多氧化还原酶的辅基，主要起传递氢的作用。人类缺乏维生素B2时可出现多种临床症状，如口角炎、唇炎、舌炎、阴囊炎、眼睑炎及角膜血管增生等。成人维生素B2需要量l.2～1.5mg／每日。

3．维生素PP

(1)化学本质：维生素PP是吡啶的衍生物，又称抗癞皮病因子。包括尼可酸及尼可酰胺。尼可酰胺在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤组成尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。

(2)生化作用及缺乏症：NAD和NADP是多种不需氧脱氢酶的辅酶，分子中的尼可酰胺部分具有可逆的加氢及脱氢特性，在反应中起递氢作用。维生素PP缺乏症称癞疲病(pellagra)，主要表现为皮炎、腹泻及痴呆。

4．维生素B6

(1)化学本质：维生素B6是吡啶的衍生物，包括吡哆醇，吡哆醛及吡哆胺。在体内以磷酸脂的形式存在。磷酸吡哆醛及磷酸吡哆胺是其活性形式。

(2)生化作用及缺乏症：①磷酸吡哆醛是氨基酸代谢中转氨酶及脱羧酶的辅酶，参与转氨基和脱羧基作用。②磷酸吡哆醛是δ—氨基γ—酮戊酸合成酶的辅酶，参与血红素的合成。③磷酸吡哆醛作为糖原磷酸化酶的重要组成部分，参与糖原的分解。缺乏维生素B6时有可能造成低血色素小细胞性贫血和血清铁增高。

5. 泛酸

(1)化学本质：泛酸又称遍多酸，是由β—丙氨酸与2．4—二羟，3，3-甲基丁酸借肽键缩而成的一种有机酸。 (2)生化作用：泛酸在肠内吸收进入人体后，经磷酸化并获得巯基乙胺而转变成4一磷酸泛酰巯基乙胺，是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的组成成分。CoA和ACP构成酰基转移酶的辅酶，参与转运酰基作用。辅酶A分子中巯基乙胺上含有巯基(-SH)，为辅酶的活性基团，故辅酶A常写成CoASH，泛酸缺乏症很少见。

6．生物素

(1)化学本质及性质：生物素(biotin)是噻吩和尿素相结合的骈环，并带有戊酸侧链的化合物。自然界有α-生物素和β-生物素两种。其性质耐酸不耐碱，氧化和高温使其失活。

(2)生化作用及缺乏症：生物素作为羧化酶的辅酶参与物质代谢的羧化反应，在反应中生物素与CO2结合起着CO2载体的作用。生物素来源广泛，很少出现缺乏症。但是，如经常食用生鸡蛋清则可能会引起生物素缺乏症。长期使用抗生素可抑制肠道细菌生长，造成生物素缺乏症。

7. 叶酸

(1)化学本质：叶酸(folic acid)，是由2-氨基、4-羟基、6-甲基喋呤啶和对氨基苯甲酸构成喋酸，喋酸再结合谷氨酸而生成。故又称喋酰谷氨酸。

(2)生化作用及缺乏症：进入人体的叶酸在小肠、肝或组织中被二氢叶酸还原酶还原为二氢叶酸(FH2)，再进一步还原成四氢叶酸(FH4)。四氢叶酸是叶酸的活性形式，是一碳单位转移酶的辅酶，作为一碳单位的载体参与多种物质代谢。叶酸缺乏时，DNA合成受抑制，细胞分裂速度下降，体积增大，造成巨幼红细胞性贫血。叶酸主要存在于新鲜绿叶蔬菜、鲜果中。人类肠道细菌可合成。所以，一般不易缺乏，但是在吸收不良，需要量增加或长期使用肠道抑菌药，可能造成叶酸缺乏症。

8．维生素B12

(1)化学本质与来源：维生素B12是唯一含金属元素钴的维生素，又称钴胺素。主要来源于动物性食物，食物中的维生素B12与蛋白质结合存在，必须在胃酸作用下才与蛋白质分开；然后再与胃黏膜分泌的内因子一种特异蛋白结合，才能吸收进入血液。在细胞内转变成多种形式，其中甲钴胺素和5’-脱氧腺苷钴胺素是维生素B12的活性型。

(2)生化作用及缺乏症：①维生素B12以甲钴胺素的形式作为转甲基酶的辅酶，参与同型半胱氨酸的甲基化反应

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