考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

吴凡 郭梦雨

摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光

度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物 1 实验部分 1.1 实验原理

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h

内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

1.2 实验准备 1.2.1 实验材料

新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2 、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。

1.2.2 仪器与设备

容量瓶（25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶 1个、分析天平、胶头滴管、烧杯（50mL 2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL 1个 、25mL 1个）、研钵、移液枪（1000μL）

UV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。

1.2.3 试剂配制

1.2.3.1 标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL； 1.2.3.2 考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 90%乙醇中，加入50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中； 1.2.3.3 提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)；

1.2.3.4 梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L； 1.2.3.5 外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、 半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V)。

1.3 实验步骤

1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描

取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。 1.3.2 标准曲线的绘制

取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程

表 1 绘制标准曲线的各试剂添加量

项目 管号 0 100μg/mL 牛血清白蛋白溶液/mL 蒸馏水/mL 1 0.2 2 3 4 5 0 0.4 0.6 0.6 0.4 0.8 1.0 0.2 0 1.0 0.8 1.3.3 果蔬组织可溶性蛋白质的提取 1.3.3.1 最佳缓冲溶液和pH值的确定

称取苹果果肉样品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用。 1.3.3.2 最佳提取缓冲液浓度的确定

以上节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液[9]。提取体系及方法同1.3.1节。 1.3.3.3 适宜外源添加物的确定

以上节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同1.3.1节。（添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇） 1.3.3.4 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。 1.3.3.5 数据处理

Excel 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。

2 结果及讨论 2.1 标准曲线的绘制

表二 不同吸光度值对应BSA含量

BSA含量μg 吸光度A

0 0 20 0.144 40 0.268 60 0.366 80 0.447 100 0.541

查阅文献得，可溶性蛋白质质量浓度高时，考马斯亮蓝G-250染色法线性降低，R=0.9929。可溶性蛋白质量浓度在80μg/mL以内时，该方法线性关系较好，相关系数R=0.9929。因此，考虑到该方法高浓度时非严格的线性关系，实际应用时，相关系数R在0.99-1范围内属基本可以接受范围。本实验R=0.9990，线性很好。

2.2 不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响

2.2.1 不同缓冲溶液对可溶性蛋白提取效果的影响

表三 水及不同pHTris-HCl对可溶性蛋白提取效果的影响

（其中，1-11分别代表水、pH为7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl缓冲溶液（100mmol/L））

不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响通常利用考马斯亮蓝G-250染色法测定植物组织微量的可溶性蛋白时，常选用的提取液包括水、Tris-HCl缓冲液和磷酸（PBS）缓冲液。本实验研究了水以及不同pH值的Tris-HCl缓冲液定苹果组织低量可溶性蛋白质的提取影响。在Tris-HCl缓冲溶液（100mmol/L）有效缓

溶液及PH值 水 PH=7.2 吸光度A 蛋白含量μg 蛋白含量% 0.129 19.19 15.35 0.151 23.29 18.63 PH=7.4 0.18 23.11 18.49 PH=7.6 0.163 25.53 20.42 PH=7.8 0.166 26.09 20.87 PH=8.0 0.160 24.97 19.98 PH=8.2 0.172 27.20 21.76 PH=8.4 0.186 29.81 23.85 PH=8.6 0.201 32.61 26.09 PH=8.8 0.218 35.78 28.62 PH=9.0 0.258 43.23 34.58 冲范围内(7.0-9.2)选取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1:5料液比制备可溶性蛋白质提取液，按制作标准曲线方法测定提取液可溶性蛋白含量，测定结果如图所示。由图可以看出：随Tris-HCl缓冲溶液

pH值的升高，可溶性蛋白质的提取效率增加；且Tris-HCl缓冲溶液提取效果明显优于水提组，其中pH7.2的Tris-HCl缓冲溶提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量仍然比水提组高17.55%；提取缓冲液pH值为9.0时提取效率最高，比水提组和提取组pH值为7.2分别高125.27%、85.61%。查阅文献得，整体上Tris-HCl缓冲溶液提取效率高于磷酸盐（PBS）缓冲溶液苹果果肉组织可溶性蛋白质提取的适宜缓冲溶液为pH值为9.0的Tris-HCl缓冲溶液。

2.2.2 不同缓冲液浓度对可溶性蛋白质提取效果的影响

表四 不同浓度Tris-HCl对可溶性蛋白质提取效果的影响

溶液mmol/L 吸光度A 蛋白含量μg 蛋白含量%

0 0.129 19.19 15.35 10 0.149 22.92 18.34 30 0.166 26.09 20.87 50 0.196 31.68 25.34 80 0.238 39.50 31.60 100 0.264 47.33 37.86

（其中，1-6分别表示浓度为0、10、30、50、80、100mmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液）

常用可溶性蛋白质提取缓冲液浓度为0.02～0.05mol/L缓冲体系，实验过程

中，选择0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液进行实验，结果如图所示。由图可知，低浓度 pH为9.0的Tris-HCl缓冲条件即可明显提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量比对照水提组高19.48%)。且随着Tris-HCl缓冲液浓度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、50、80、100mmol/L缓冲溶液可溶性蛋白提取量分别比对照高35.96%、65.08%、105.86%、146.64%。其中，100mmol/L缓冲液提取效果最佳，其可溶性蛋白有效提取量比80mmol/L缓冲液仍高出19.81%。

2.2.3 外源添加物对可溶性蛋白提取效果的影响

以上述实验确定的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为基础提取液，添加蛋白酶保护剂和抑制剂，进一步探讨外源添加这些物质对真实测定果蔬组织中可溶性蛋白质的含量的影响。分别选取抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2以及这些试剂的不同组合进行实验，以不添加任何添加物的100mmol/L，pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液为对照，结果如下图所示。

表五 不同外源添加物对可溶性蛋白质提取效果的影响

外源添加物 抗坏半胱血酸 氨 酸 EDTA PVP β-巯基乙醇 NaCl MgCl2 PVP＋β-巯基乙醇 PVP＋EDTA EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇 无 吸光度A 蛋白含量μg 蛋白含量%

0.215 0.243 35.22 40.43 28.18 32.34 0.326 55.90 44.72 0.354 61.12 48.90 0.173 27.39 21.91 0.163 25.52 20.42 0.180 28.69 22.95 0.191 30.74 24.59 0.383 66.52 53.21 0.201 32.61 26.09 0.261 43.44 34.75

（其中，A-J分别代表抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇）

单独添加2mmol/L半胱氨酸对可溶性蛋白提取效果无明显影响；单独添加2mmol/L抗坏血酸、0.15mmol/LNaCl、2%β-巯基乙醇和0.15mmol/LMgCl2对该浓度和pH值的缓冲液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，这4种物质处理后，可溶性蛋白提取量分别比对照组低23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。从β-巯基乙醇和PVP及EDTA的复合处理结果也可看出其对果实可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP＋β-巯基乙醇处理组可溶性蛋白测定量比PVP处理组低，PVP＋EDTA＋β-巯基乙醇处理组可溶性蛋白含量比PVP＋EDTA组低；单独添加PVP和EDTA均有助于提高果实可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比对照高40.71%)好于EDTA(比对照组高28.69%)。而PVP和EDTA复合处理效果比单独处理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量比对照高53.12%。

2.3 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

表六 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

次数 吸光度 蛋白含量μ蛋白含平均值

1 2 3 项目 0.260 0.263 0.258 g 43.60 44.16 43.23 量% 34.88 35.33 34.58 34.93 上述研究结果表明，以考马斯亮蓝G-250染色法测定组织微量蛋白含量时，果实可溶性蛋白提取受提取液pH值、缓冲盐种类、缓冲盐浓度、外源添加物PVP和EDTA等因素影响。实验最终确定的适用于苹果果实可溶性蛋白含量测定的提取条件为，0.1mol/L,pH为9.0的Tris-HCl提取缓冲液(内含1mol/LEDTA和1%PVP)，1:5料液比，此条件下，果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%（mg/g）

3 其他 3.1 实验流程图

3.2 考马斯亮蓝法的优点

3.2.1 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 3.2.2 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

3.2.3 干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

3.3 考马斯亮蓝法的缺点

3.3.1 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

3.3.3 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

3.3.3 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

3.4 染料考马斯亮蓝有G250 和R250 两种形式

在颜色索引（Colour Index）中给出了不同的编号（42655和42660）。亮蓝G和亮蓝R在冷水中分别为微溶和不溶，在热水和乙醇中分别为可溶和微溶。两种染料均能对固定的蛋白有效地进行染色，使用浓度为溶于甲醇:冰醋酸:水（50:10:40）的0.05%溶液。但考马斯亮蓝R250尤其适用于SDS-PAGE电泳微量蛋白质的染色,所以本次实验选择了考马斯亮蓝G250。

3.5 测定时间

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。如果要求严格，最好在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

3.6 比色皿的清洗

染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗

涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。

3.7 混合方式

若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡难于消除。

3.8 实验中选用BSA作为蛋白质含量标准曲线的优点

3.8.1 易于获得。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），含量高，易于获得，而且提取纯化也容易。是来源和纯化都成本很低的蛋白质。 3.8.2 氨基酸含量较全。含有16种氨基酸，虽然不全，但也差不多了。由581个氨基酸残基组成（可能不同来源的BSA稍有不同），其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。不同的测定方法的原理都不同，但是氨基酸残基多的蛋白质可以对多种测定方法起反应。

3.8.3 分子量适中。 溶菌酶属于最小的酶，才约10KD，BSA的分子量约68KD，在蛋白质单体里不大不小。BSA是较对称的心形蛋白质，蛋白质的大小不同，氨基酸个数和蛋白质表面积的比值是不同的，分子量适中的蛋白质在蛋白质含量中具有代表性。

3.9 实验材料的选择

苹果具有极高的营养价值，有食疗、辅助治疗功能中国是世界最大的苹果生产国苹果中营养成份可溶性大，易被人体吸收，故有“活水”之称。多年来，人们对苹果中糖类及维C的研究颇多，对蛋白质等其他成分研究较少。苹果中含有微量蛋白质，故本实验采用了新鲜苹果做实验材料。

致谢

感谢老师对我们实验准备提供的帮助以及11教507！