一 基因工程与食品

（一）名词解释

1.基因工程：是指将目的基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的技术。

2.限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

3.DNA连接酶：是一种能在ATP或NAD+存在下催化双链DNA片段紧靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶。

4.DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，可在其催化下进行DNA体外合成反应 DNA修饰酶：这类酶能对DNA分子进行一些比如3’末端加dNTP或5’末端添加/脱除磷酸基团等等的修饰

T4噬菌体多核苷酸激酶：是一种能催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5’-OH末端的酶，它对底物分子长度没有限制。

5.碱性磷酸酶：这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端

6.启动子：是指一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。

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8.终止子：是指一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列，分为本征终止子和依赖终止信号的终止子。

11.克隆载体：是指能在细胞内进行自我复制的外源基因运载体，如细菌质粒、λ噬菌体、M13噬菌体及粘粒等。

12.质粒：是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。

13.穿梭质粒：是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带外源DNA在不同物种的细胞间往返穿梭的质粒载体。

14.粘粒载体：是一类人工构建的含有λDNA粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。

15.噬菌粒：是指质粒载体与M13噬菌体的基因间隔区重组而成的噬菌体载体，同时具有二者的复制起点。

16.感受态细胞：是指具有能够接受外源DNA的生理状态的受体细胞，一般处于对数生长期后期，时间短暂，但经氯化钙等处理可使细胞进入这一状态。

17.转化：是指把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程。

18.转染：是指将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。

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19.转导：是指将重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将头部重组DNA导入受体细胞中。

20.化学转化法：对受体细胞经过氯化钙、氯化铷等化学试剂的处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变从而使受体细胞进入感受态，再经过热击、冷冻等处理即可将外源DNA摄入。

21.电穿孔转化法：是指利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法。 基因定点诱变：是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等

22.SD序列：Shine-Dalgarno序列，即核糖体结合位点，是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，它与核糖体16S rRNA特异配对而与宿主核糖体结合，对mRNA的翻译起决定性作用。

23. DNA体外重组：是指将目的基因（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上形成重组DNA。

24.抗生素抗性基因插入失活法：载体的抗药性基因内具有限制酶的识别位点，用某种限制酶消化并再此位点插入外源DNA时，抗药性基因不再被表达，当这个重组载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转为敏感，便可筛选出重组转化子。

25.β-半乳糖苷酶基因插入失活法：质粒载体上LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶N端与受体细菌编码的C端片段实现а互补而具有酶活性，可在IPTG诱导下分解

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生色底物X-gal并形成蓝色菌落，但当外源片段插入质粒的多克隆位点后，使β-半乳糖苷酶的N端失活从而破坏а互补，因此带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而可依据菌落的颜色筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落。

26.电镜R-环检测法：在分子杂交中，核酸探针与部分变性的双链DNA分子中的互补单链形成杂合双链，同时另一条单链向外突出，二者形成泡状体，即R环结构，可用电镜直接观察，从而可以检测双链DNA中是否含有目的序列。

（二）问答题

1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ （一）能独立自主的复制 （二）能便利的加以检测

（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。

2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 特征： (1)染色体外的双链环状DNA分子 (2)大小为1～200kb；

(3)能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中可含10～200个拷贝。 (4) 分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿主范围 (5)质粒包含:复制起始区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点 主要类型：pBR322、pUC19

3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？

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入-噬菌体 DNA长度约为48.5kb(分子量3.2×107)

柯氏质粒／粘尾质粒 其本身分子量小，如pHC79仅6.5kb，可容纳40kb左右的DNA片段。

4. 什么是穿梭载体？

复制型载体又称穿梭载体: 能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体.

5. 表达载体应该具备什么条件？

表达载体（Expression vector）具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SDs和RbS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。

6. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？

一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。

所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水 解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）

限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。 （1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，

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不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核苷酸切割的位点一致，但罕见）。

（2）Ⅱ型 基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段

7 如何将不同DNA 分子末端进行连接？

1） T4 DNA连接酶

2） 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法： 同聚物加尾法 衔接物法 接头连接法

8. 碱性磷酸酶有什么作用？

该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。

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9. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？

能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用的底物可以是具有3’-OH 末端的单链DNA, 也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA

10. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA 片段？ 要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。

11. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？ 1.) 反应温度：

连接缺口的温度：37度

连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2.)Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：

平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位 ATP的用量10μmol-1mmol/L之间

3.) 提高外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）

12 什么是基因组文库法？其构建方法是怎样的？

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采用限制性酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体。简单的说就是汇集某一基因组所有ＤＮＡ序列的重组ＤＮＡ群体．以λ噬菌体和柯斯质粒为载体构建． 其具体的构建方法：

1）从生物体提取大片断的基因组DNA；

2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；

3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）；

4）载体的酶切、回收；

5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接； 6）将重组子导入宿主细胞 7）文库的鉴定、收集、保存；

13. 什么是cDNA文库法？它的构建流程是什么？

cDNA：指体外用逆转录酶催化，以mRNA为模板合成的互补DNA。

cDNA文库：汇集某生物成熟mRNA为模板逆转录而成cDNA序列的的重组ＤＮＡ群体．Λ噬菌体和质粒为载体构建． 操作程序

１）总RNA的提取；注意抑制ＲＮＡ酶的活性，盐酸胍，二乙基焦碳酸

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２）mRNA的分离：选用高度分化的组织，末端带有poly A. ３）cDNA双链的合成： ４）cDNA与载体的连接

５）噬菌体的包装以及转染或质粒的转化

14. 构建cDNA 文库需要用到哪些工具酶？

逆转录酶，DNA聚合酶I，单链核酸酶 S1，末端转移酶，限制性核酸内切酶，DNA连接酶

15.合成cDNA 第二条链有哪些方法?

合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。

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二 发酵工程

1、什么是种子的扩大培养？

将保存的处于休眠状态的生产菌种接入到试管斜面活化后,再经过茄子瓶或摇瓶以及种子罐扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程

2， 什么是培养基?培养基的配置原则

定义: 一种人工配制的, 供微生物生长繁殖和形成代谢产物用的营养培养物质. 培养基的配制原则：

a根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基

b注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势 c营养成分的恰当配比（C/N一般取100 : 0.2～2.0） d渗透压，营养物质要有合适的浓度

e合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入） f氧化还原电位

g考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀 3、 什么是前体？

某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。 有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。

4、 什么是生长因子？生长因子的来源？

从广义来说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、

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维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。

提供生长因子的农副产品原料： 1）玉米浆 2）麸皮水解液 3）糖蜜

4）酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。 5、种子扩大培养的目的与要求及一般步骤？

（1）目的：其任务是要得到纯而壮的培养物，获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 （2）种子的要求

①菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。 ②菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求。

③菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 ④无杂菌污染，保证纯种发酵。

⑤菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。 （3）一般步骤：

休眠孢子→母斜面活化→摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐

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6. 泡沫对发酵有哪些有益之处，哪些有害之处？ 少量泡沫的作用：（有益之处）

一定数量的泡沫是正常现象，可以增加气液接触面积，导致氧传递速率增加；

大量的泡沫引起许多负作用：（有害之处） 发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小； 增加了菌群的非均一性； 造成大量逃液，增加染菌机会；

严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶； 消泡剂的添加将给提取工序带来困难。

7、什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？ 接种量＝移入种子的体积/接种后培养液的体积 细菌5℅、放线菌20℅ 霉菌10%

8、什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？ 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵

1、发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。 2、级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。 3、 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面

种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种

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子和三级种子的制备。

孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子.将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵

9、影响微生物需氧的因素有哪些？ 如何调节摇瓶发酵的供氧水平？如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？

影响微生物需氧的因素：（1）培养基的成分和浓度（2）菌龄（3）发酵条件 a调节搅拌转速或通气速率来控制供氧；

b控制补料速度来控制基质的浓度，从而达到最适的菌体浓度，保证产物的比生长速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。

c采用调节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度）、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水平。

如何调节摇瓶发酵的供氧水平？

往复，频率80-120分/次，振幅 8cm 旋转，偏心距转速250rpm 装液量，一般取1/10左右：

250ml 15-25 ml 500ml 30 ml

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750ml 80 ml

如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？

一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。

10、pH对发酵的影响表现在哪些方面？ 发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？

Ph对发酵的影响表现：

1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；

2）影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；

3）pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

4）影响氧的溶解,氧化还原电位,营养物的物理状态等。 发酵过程中的ph控制采取的措施：

1）首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。

2）在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制；补充生理酸性物质（如(NH4)2SO4）和生理碱性物质（如NaNO3）来控制。

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3）选用不同代谢速度的碳源和氮源种类和比例 4）通过调整通气量

11、发酵过程温度的选择有什么依据？ 在生长阶段，应选择最适生长温度； 在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。 发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择。 12.湿热灭菌原理，采用高温瞬时灭菌原因是什么。 湿热灭菌的原理：

每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，当微生物处于最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基本成分——蛋白质发生不可逆的变化，即凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的。 【在同一温度下，湿热效力比干热为大。 原因：（1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固； （2）湿热的穿透力比干热大； （3）湿热的蒸汽有潜热存在。 】 采用高温瞬时灭菌的原因：

由于灭菌时的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E’，因此，随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数>培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，超过了培养基营养成分破坏的速度。 据测定，每升高10℃，速率常数的增加倍数为Q10。

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在热灭菌的过程中，同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。 温度能加速其过程进行的速度，当温度升高时，微生物死亡的速度更快， 因此可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。

13.工业化菌种的要求？

1）细胞或菌体 菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。

菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标

⑵ 生化指标 种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、

物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标

⑶ 产物生成量 种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。

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⑷ 酶活力 测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。

此外，种子应确保无任何杂菌污染。

14.什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？

自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然选育在工业生产上的意义：

自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。

自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

15.发酵生产用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？

在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。

碳源 来源

葡萄糖 纯葡萄糖，水解淀粉

乳糖 纯乳糖，乳清粉

淀粉 大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等

蔗糖 甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等

生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。

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酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。

甲醇作为底物生产单细胞蛋白（SCP）用烷烃进行有机酸、维生素等的生产

网络答案：

碳源:糖类（淀粉、葡萄糖、蔗糖等）、油脂（动、植物油）、有机酸（琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等）和低碳醇（甲醇、乙醇等）。

糖类:葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应

糖蜜，是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。

淀粉、糊精，缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。

16.什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？

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无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。

17.为何氧容易成为好氧发酵的限制性因素？

氧是需氧微生物生长所必需的。氧往往容易成为控制因素，是因为氧在水中的溶解度很低，培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟内全部耗尽，使溶氧成为控制因素。

18简述通用试发酵罐的结构

【通用式发酵罐：具有通气和搅拌装置的立式圆筒形发酵罐。是目前大生产中最常用的发酵罐。其容积可从几升到几百吨不等。包括罐体、搅拌系统、传热系统、通气系统。 （1）罐体 （2）搅拌系统包括：驱动电机、搅拌轴；涡轮搅拌器、搅拌叶；挡板；轴封（端面轴封） （3）传热系统包括夹层传热、蛇管传热（一般有4组、6组、8组）。 （4）通气系统包括单孔管、多孔环管】

通用式发酵罐的主要部件==

罐体 搅拌器 挡板 轴封 空气分布管 消泡器 冷却管（或夹套）联轴器

中间轴承 人孔 管路等

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19、什么是种子的扩大培养？

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子

20、种子扩大培养的目的与要求、一般步骤？

休眠孢子→母斜面活化→摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵

21、在大规模发酵的种子制备过程中，为什么包括实验室阶段和生产车间阶段？

实验室阶段培养物选择的原则：种子能扩培到一定的量和质，获得一定数量和质量的孢子/菌体。培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。 生产车间阶段培养物的选择原则最终一般都是获得一定数量的菌丝体。培养基选择首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本二是驯化

22、什么是接种量？

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移入种子的体积

接种量＝ ————————

接种后培养液的体积

23．什么是种龄？种龄确定的依据？

种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。

三 酶工程

1.酶分离纯化操作的一般程序和目的？

：

细胞破碎 动物、植物或微生物细胞

酶提取 酶分离纯化 发酵液

酶浓缩 酶贮存

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目的：将酶以外的所有的杂质尽可能的除去。

2.如何检查一种酶制剂是否达到了纯的制剂？

要检测酶的制剂是否达到纯的制剂（即不含杂质及杂质酶），可以有以下几种方法： （1） 层析法：包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析 （2） 电泳法：包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （3） 超离心法：不同的酶分子大小不同，在重力场中具有不同的沉降系数，从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。 （4） 免疫反应法：由于酶分子可作为一种抗原物质，而抗原与抗体之间具有专一的亲和力，故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳，从而判断酶的制剂是否纯净。 （5） 氨基酸序列分析法：采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来，最终可获知该酶的氨基酸序列，从而也可以判断出酶制剂是否纯净。

3.有三种酶蛋白，其相对分子质量和等电点各不相同，试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。

【1、沉淀，

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。 3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

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4、层析：

a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。

5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。】

4.细胞破碎的目的、方法及原理。

目的：许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。

方法及原理：

a机械破碎--通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。--捣碎法 研磨法

匀浆法

b物理破碎--通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。--温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法

c化学破碎--通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎---有机溶剂：甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂：Triton、Tween

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d酶促破碎--通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎--自溶法 外加酶制剂法

5 常用沉淀法的种类及原理。盐析法分离蛋白质的原理。

沉淀分离方法 分离原理

【盐析沉淀法】 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特

性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离

【等电点沉淀法】 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

【有机溶剂沉淀法】 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添

加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

【复合沉淀法】 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，

从而使酶与杂质分离

6 酶固定化后性质会发生什么变化？原因是什么？

水溶性酶与水不溶性载体通过固定化技术结合形成水不溶性酶。

固定化酶的特点：

优点：1.不溶于水，易于与产物分离；

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2.可反复使用；

3.可连续化生产；

4.稳定性好。

缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活

网络【1

2

3pH

4

关系。对于低分子量的底物变化前后不大。特异性的改变时由于载体空间位组作

】

7 简述酶的提取方法及影响酶提取的主要因素。

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8试论述如何利用本章所学的各种分析技术对特定的蛋白酶进行酶学性质（如分子质量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）研究。

9 层析在实验室和工业化生产中应用很广泛，何为层析？简述常用的三种层析分离方法的原理及适用范围。

层析技术是近代生物化学实验中常用的分析方法之一，任何层析过程都是在两个相中进行的。一是固定于支持物上的固定相，另一是流经固定相的流动相，由于样品中各组分理化性质（如溶解度、吸附能力、分子形状、分子所带电荷的性质和数量、分子表面的特殊基团、分子量等）不同，表现出对固定相和流动相的亲和力各不相同。当混杂物通过多孔的支持物时，它们受固定相的阻力和受流动相的推力也不同，各组分移动速度各异并在支持物上集中分布于不同的区域，从而各组分得以分离。常用的层析分离方法吸附层析；分配层析；离子交换层析；凝胶层析；亲和层析。

10常用沉淀法的种类及原理。盐析法分离蛋白质的原理

同5

11膜分离的种类、原理及应用。

膜分离--膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜

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的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。

1加压膜分离 --微滤 超滤 反渗透

2电场膜分离 --电渗析 离子交换膜电渗析

3扩散膜分离 --透析

12比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析 在原理、层析介质、操作及应用方面的异同点。

层析方法 + 分离依据 吸附层析-- 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离。

【吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。

吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。

层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。

在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法 置换洗脱法 前缘洗脱法 】

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分配层析-- 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离。

【分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。

在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。

纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析 】

离子交换层析--利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的

【离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。

按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 】

凝胶层析-- 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离

【凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。

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