实验四 继代培养

一、 实验目的和要求 1、了解继代培养的目的； 2、学会继代培养基的设计和配制； 3、学会继代培养方法。 二、 继代培养原理和说明 继代培养是将中间繁殖体接种到适宜的增殖培养基中在适宜的条件下培养以繁殖出更多同种中间繁殖体的过程。继代培养是植物组织培养的关键步骤，直接关系到快繁效率和变异频率的高低，影响继代培养效果的因素有培养基、培养条件、培养方法和切割方法等。因此学会继代培养方法，建立高效继代培养技术体系至关重要。 三、实验材料及设备 实验材料：水稻愈伤组织 实验设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、解剖刀、酒精灯等；75%酒精 四、实验步骤 （一） 培养基的设计和配制 MS + 0.5mg/L 6-BA + 2mg/L 2,4-D + 5.5g/L 琼脂粉 + 30g/L 蔗糖 配制方法同前。 （二）选材料 对初代培养的材料仔细观察，选取没有污染的愈伤组织为材料。 （三）接种培养 1．接种前，用75%酒精棉擦拭超净台台面，将培养基及接种用具放入超净台台面，打开超净台紫外灯，照射约20~30min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10min后，再开日光灯即可进行外植体的消毒和接种等无菌操作。 2．75%酒精棉擦手消毒。 3．用75%酒精棉擦拭所选取材料的培养瓶，特别是瓶盖周围，然后放入超净台内。用 4．把带愈伤组织小苗取出放在已高压灭菌好的碟子里，用解剖刀切去除种子和小苗，留下愈伤组织，将其切成适当大小，接入培养基里，每瓶接6块，共接32瓶。 5．接完后，在瓶盖上注明材料名称、接种日期和组名。将材料放入２６℃～２８℃，散射光下培养。 四、实验结果与分析 1．培养过程中观察污染情况，记录污染瓶数，计算污染率。 污染率＝污染的瓶数／总的瓶数×１００％ 2．培养过程中愈伤组织生长状况，估计增值率 。 五、复习思考题 1、怎样减少继代培养的污染率？ 2、怎样进行继代培养？ 一、实验目的

通过实验了解植物器官继代培养的方法。 二、实验原理

将诱导产生的芽、苗、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程称为继代培养，也称为增殖培养。该过程是植物组织培养中决定繁殖速度快慢、繁殖系数高低的关键阶段。继代使用的培养基对于一种植物来说，每次几乎完全相同。由于培养物在适宜的环境条件、充足的营养供应和生长调节剂作用下，排除了其他生物的竞争，繁殖速度大大加快。 三、材料和设备

1、材料 ：从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体 2、试剂及设备：培养基、三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀、70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球、酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶 二、实验步骤

1 取材 在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20 毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状,不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。

2 继代转接 将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。

3 实验记录将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化,培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。

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