第一章 基因工程

狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因.

广义的：是指DNA重组技术的产业化设计与应用，分为上游和下游。

概念：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 基因工程的三大理论基础

1 . 40年代，证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导） 2 .50年代，DNA的双螺旋结构和半保留复制机理

3 .60年代，提出遗传信息的传递方式（中心法则）和操纵子学说 第二章 限制与修饰

由宿主控制的对外源DNA的限制和对内源DNA的修饰现象称为宿主细胞的限制和修饰作用。

限制性内切酶的星活性

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星活性现象。 影响活性的因素

DNA 的纯度2.DNA的甲基化程度3.酶切反应的温度4.DNA的分子结构5.限制性核酸内切酶的缓冲液 DNA聚合酶

能够在DNA分子的3’羟基端加dNTP的酶是DNA聚合酶 S1核酸酶

能够降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。 切除发夹环结构 逆转录酶

依赖于RNA指导的DNA聚合酶是 逆转录酶。 碱性磷酸化酶

1. 5’末端标记前的处理 2.去除DNA或者RNA的5’磷酸，可防止自身环化。 甲基化酶

大肠杆菌中作用于特定核苷酸序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化；另一种是dcm甲基化酶。因此，从正常的大肠杆菌菌株忠分离出来的质粒DNA,只能被限制性合算内切酶局部消化，甚至完全不被消化。 同裂酶

来自不同物种，但是识别序列和酶切位点均相同。 同尾酶

具有不同的识别序列，但是酶切产物有相同的末端结构。 第三章

质粒载体特征

载体:携带外源基因进入宿主细胞，并使外源基因持续稳定地复制表达的工具称为载体。 1.自主复制性

2.携带特殊的遗传标记 3.质粒的可转移性

4.质粒的不相容性 不亲和性

在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定地共存的现象,称为质粒的不亲和性。 M13载体

M13噬菌体是一种线状、单链DNA的丝状噬菌体,可以使插入的外源DNA片段变成单链。 其用途是：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序 （2）用于单链DNA的定点诱变

（3）用于合成同位素标记的单链探针 （4）克隆和分离单链的外源DNA片段 粘粒载体：含有λ-DNA两端cos区的质粒 具有吊打克隆能力的新型克隆载体 基本特点：1.具有λ噬菌体的体外包装

2.具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性 3.具有高容量的克隆能力

4.具有与同源序列的质粒进行重组的能力 YAC载体

YAC是指酵母人工染色体载体。

YAC 载体在酵母中复制的必需元件包括:（1）自主复制序列（2）用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 ，（3）两个端粒 Ti质粒载体的结构

T-DNA区 （B）毒性区(C).接合转移区 (D).复制启始区 第四章 核酸的检测

紫外光谱分析法 2.琼脂糖电泳检测 3.聚丙烯酰胺凝胺电泳检测 电泳的方法，原理

常用于核酸电泳的方法是(1) 琼脂糖凝胶电泳 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳.

核酸凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸分子迁移速度出现差异，从而把它们分开。一般说，同样构象的分子，分子量越大，迁移越慢；胶浓度越大，迁移越慢。 变性和复性

变性:蛋白质或核酸分子中除了连接氨基酸或核苷酸链的一级化学键以外的任何天然构象的改变。

DNA变性：即双链DNA模板加热变性成单链.

DNA复性：变性的DNA在合适的条件下断裂的氢键重新形成，恢复DNA双链的过程。 Southern Blot

Southern杂交是指DNA和DNA之间的杂交,可以检测转化体中的拷贝数. Sanger测序技术支持

三大技术支持是：1. DNA聚合酶的 聚合特性； 在模板和引物退火后，DNA聚合酶在引物的3’ 羟基端，按互补配对原则，互补的 DNA 链。 2. 利用2’3’双脱氧核苷酸的终止特性；2’3’双脱氧核苷酸无羟基，DNA不能延伸。控制反应中单脱氧和双脱氧核苷酸比例。 3.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率特性；大小仅差一个核苷酸的DNA片段也可分开经放射自显影后读出DNA序列。 第五章

PCR原理和步骤

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段.可看作生物体外的特殊DNA复制.

变性：即双链DNA模板加热变性成单链.退火：在低温下引物与单链DNA互补配对.延伸：在适宜温度下TAPDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸.这三个基本步骤构成的循环重复进行

PCR扩增模板,要求一对寡核苷酸引物,4种脱氧核糖核三磷酸酸（dNTP）,镁离子,TapDNA聚合酶

1,变性加热至94-95时,模板DNA双螺旋的氢键断裂,双链解链,形成单链DNA

2,退火 当温度突然降至50-65,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链3,延伸 72-75下,在TAPDNA聚合酶和4种脱氧核糖核三磷酸酸（DNTP）及镁离子存在条件下,以引物为起始点沿着互补的单链模板进行DNA链延伸反应. 荧光定量PCR定义

荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 第六章

基因组文库定义，如何构建

汇集着基因组所有的DNA序列的重组体DNA群体 称为基因组文库。

如何构建基因组文库？(1) 细胞染色体大分子 DNA的提取和部分酶切 （2）载体DNA的制备（3）载体和外源DNA的连接转化或包装侵染（4）文库的质量检测 cDNA文库定义，如何构建

由mRNA反转录得到的cDNA片段,与合适的载体相连形成重组 DNA,重组DNA分子转化大肠杆菌所得到的所有菌落构成cDNA文库.

如何构建cDNA文库？cDNA文库的构建包括以下几个步骤：（1）分离细胞总RNA.(2)合成cDNA第一链.(3)合成cDNA双链分子.可以采用自我引导法,RNaseH酶降解法等置备cDNA双链.(4)双链cDNA重组到载体上,导入寄主细胞增殖. 第七章

报告基因定义，有哪些报告基因？ 报告基因：是指用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因。常用的如：1.新霉素磷酸转移酶基因2.双氢叶酸脱氢酶基因3.潮霉素磷酸转移酶基因4.氯霉素乙酰转移酶基因5.冠瘿碱合成酶基因 6.β-葡萄糖苷酸酶基因 7.荧光素酶基因 第八章

表达载体特点

复制起始点2.选择性基因3.强的可诱导的启动子4.强的转录终止序列5.核糖体结合位点6.合适的多克隆位点 包涵体产生原因

（1）重组蛋白本身特性;（2） 二硫键形成的氧化还原环境不佳.（3）重组蛋白过度表达;（4）宿主菌缺乏蛋白折叠和运输所需的一些酶和辅助因子.（5） 重组蛋白表达处周围的化学条件不合适;（6） 宿主菌生长状态. 外源基因在大肠杆菌表达方式

主要有包涵体、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白等5种。 第九章 YAC载体

YAC是指酵母人工染色体载体(同第三章的)

第十章

Ti质粒机理

农杆菌Ti质粒的作用机理是什么？（1）.农杆菌对植物细胞的识别和附着；（2）.农杆菌对植物信号的感知；（3）.农杆菌Vir基因的活化；（4）.T-DNA复合物的产生；（5）.T-DNA复合体的转运（6）.T-DNA整合到植物基因组 转化方法

间接：农杆菌介导法2.病毒介导法 直接：化学物质诱导法2.电穿孔法3.脂质体法4.微注射法5.基因枪法6.离子束介导法7.花粉管通道法

转基因植物的应用 培养抗虫、抗病毒的转基因植物2.培养抗除草剂转基因作物3.提高植物的抗逆性4.改良作物的营养品质及延长果实的货架期5.生产药用蛋白质。 第十一章 胚胎干细胞

是指从动物早期胚胎分离的具有自我更新能力和分化潜能的细胞。 转基因动物定义，转入基因的方法 转基因动物：借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，使之具有新的稳定遗传性状的动物。

方法：原核显微注射法、体细胞核移植技术、反转录病毒载体感染法、精子载体导入法和胚胎干细胞移植法等 转基因动物的应用

建立诊断和治疗人类疾病的动物模型2.用转基因动物生产药用蛋白3.生产可用于人体器官移植的动物器官4.基因动物在培养家畜新品种方面的应用5.展望