石蜡切片步骤

一、 取材

按照需要取材，材料体积限制在0.6cm x 0.4cm x 0.3cm，便于溶液渗入。切取材料要迅速,切口尽量平整。

二、 固定与脱水

常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。用F.A.A固定液固定，时间至少24小时。F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

脱水的目的是除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。

将材料置于玻璃小瓶，加入以下各溶液，溶液体积需为材料总体积的20倍以上。以下为FAA固定法。

幼嫩材料： 1． 2． 3． 4．

材料浸入50%乙醇的FAA，4℃真空抽气30min； 4℃过夜；

50%乙醇清洗30分钟，换新50%乙醇重复一次；

70%乙醇浸1－2小时，85%乙醇浸1－2小时，95%乙醇浸1－2小时，100%乙醇浸1－2小时，换新100%乙醇浸1－2小时。 非幼嫩材料： 1． 2． 3． 4．

材料浸入70%乙醇的FAA，4℃真空抽气30min； 4℃过夜；

70%乙醇清洗30分钟，换新70%乙醇重复一次；

85%乙醇浸1－2小时，95%乙醇浸1－2小时，100%乙醇浸1－2小时，换新100%乙醇浸1－2小时。

如后续步骤为原位杂交，强烈建议用含4%多聚甲醛的PBS（不含戊二醛）做为固定液固定过夜，然后从30%的乙醇溶液开始，同上所述逐步过渡到100%乙醇。

用95%酒精配制各浓度酒精的方法：设原有酒精浓度为A，所需配制酒精浓度为B，则取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸馏水，即可获得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精，则取70ml的95%酒精，加上25ml蒸馏水，则配成了95ml的70%的酒精。 三、 透明与浸蜡

透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增加折光系数；同时便于下步的浸蜡和包埋等程序（因为究竟不能溶解石蜡）。

透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。

材料依次转入不同浓度的氯仿和乙醇混合溶液，其中氯仿分别占1/5、2/5、3/5、4/5和纯氯仿，然后浸蜡。具体如下：

5． 6． 7．

在氯仿占1/5的溶液中浸3－4小时，在氯仿2/5的溶液中浸3－4小时，在氯仿占3/5的溶液中过夜；

在氯仿占4/5的溶液中浸3－4小时，在纯氯仿中浸3小时，换新氯仿浸3小时；

用刀片削入碎蜡屑至饱和，分2次加入，先少后多，每次加入后，置38－40℃温箱融化。

浸蜡时材料不要太多，瓶塞不要太紧。

一般所用的石蜡分软蜡（熔点40℃ 以下）和硬蜡（熔点40℃以上）。浸蜡过程一般是从低温到高温、从低熔点到高熔点逐渐进行，这一过程不能操之过急，否则浸蜡不彻底影响切片。此外，软材料可用熔点较低石蜡，较硬的材料可用熔点较高的石蜡；冬季可用熔点较低的石蜡，夏季可用熔点较高的石蜡。石蜡必须纯净，不含杂质。整个浸蜡过程需在恒温箱内进行（按需要调整温度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蜡，浸蜡过程中逐渐使二甲苯挥发，并不断加入纯石蜡，直至石蜡饱和为止。浸蜡时间大约1~2天。 四、 包埋

准备工作：

1）配25%，50%，75%，100%①，100%②，100%③，100%④共7级石蜡。100%①-③均为纯石蜡。100％④改为9份石蜡加1份蜂蜡，熔解摇匀，过滤至杯中，用来包埋（需配2杯）。7杯均需在杯身和杯盖标清名称。

配法例如：25%石蜡即称取40g石蜡熔解，再加入120ml二甲苯（通风橱内进行），摇匀后，用三层纱布过滤至瓷杯中（前六级石蜡按照反顺序配制和过滤）。

2）做材料盒。1.5cm*1.5cm*2.5cm大小，底部用针戳较多小孔（孔径需小于材料），上面要有提绳，挂一个回曲针，纸盒不能用胶水粘合，用牛皮纸。几种材料就需几个纸盒。

3）做包埋纸盒。6cm*3cm*2cm大小，纸盒不能用胶水粘合，用牛皮纸，盒底一角用铅笔粗写材料号，号码反着写。几种材料至少需要几种纸盒。

步骤：

1．37℃熔化小瓶中物质，镊取材料至各材料盒。将纸盒缓缓浸一半至梯度石蜡中让回曲针挂在石蜡杯外，吊住盒子。每级石蜡浸置1小时，25％那一级只

需0.5小时。25％石蜡需42度，50％和75%石蜡需52度，100％石蜡需57度。每次换时，要等蜡从材料盒底部小孔滴尽后再转入下一杯；

2．在包埋纸盒下垫一片载玻片，再盛入一半多体积的100%④石蜡。倒掉材料盒中的石蜡，夹取未凝的材料摆入包埋盒中，可横二行，纵三行。每堆材料面积不能太大，堆与堆之间要隔开一些，防止切割时弄碎；

3．包埋盒内石蜡表面凝后，连玻片一起放入水盆内水面，让其漂浮。约十几分钟凝后，小心撕掉盒子的纸，反转蜡块，让其继续在水中漂浮过夜。

五、切片

如后续步骤为原位杂交，务必将所用器具用氯仿浸泡或擦拭，包括切片刀、毛笔（只浸毛端，防止固着毛的连接部分进氯仿，否则会脱毛）、镊子等。 1．切割下含单一材料的石蜡块，削成正立体梯形，切口平整，上下边一定要平行。滴蜡到小台木上，烧热刀片，借刀片热量融合材料块到台木的蜡上。 2．将已固定材料块的台木装在切片机的夹物台上，注意要水平。

3．将切片刀固定在刀夹上，摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。调整材料块与刀口之间的角度与位置，刀面与材料块上下沿平行，切片刀倾斜度约为15度左右。

4．调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为10微米。之后开始切片，右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以10~20r/min。

5．待切片形成一定长度的蜡带后，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在染色缸内，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

6．切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。 六、粘片及展片

如后续步骤为原位杂交，除用多聚赖氨酸处理以外，载玻片还需如下处理。载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于蒸馏水中浸泡2小时以上，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡4小时以上，蒸馏水冲洗、烘干。锡箔纸包裹后，置于180度的烘箱内6小时以上以去除任何Rnase，处理后可较长期存放。在进行切片的前一天，超净无菌台上打开锡箔纸包装，玻片可放在氯仿处理过无Rnase污染的湿盒上，滴加100μg/ml多聚赖氨酸150μl，另取一玻片覆盖其上，静置30分钟，然后分开两块玻片，在粘有多聚赖氨酸溶液的一面作好记号，转入处理过的染色缸中，42℃烘干，待杂交时使用。

1．取一片处理好的的载玻片，放置于设定为42℃的展片台上。滴1~2ml的DEPC

处理水在已涂粘片剂的载玻片上。

2．用小镊子夹取所需的蜡带，放在水面上，注意蜡片与水面之间不能有气泡，此时蜡片因受热而伸展摊平。

3．稍倾斜玻片，用枪头在不伤害材料的情况下吸尽DEPC处理水。展片后把载玻片放在42℃的展片台上编好记号。

4．待玻片上的水完全干后，转移至染色缸中，可用手套包好染色缸，防止Rnase污染，42℃温箱粘片过夜，待用。

七．脱蜡：

选取头天晚上37℃烘烤过夜的片子入纯二甲苯三次，每次10min。然后依次换二甲苯:乙醇=1:1、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、15%乙醇和双蒸水，每级各2min。换新双蒸水，2min。最后37℃烘片待用。

注意事项

1.取材的注意事项：

要选取新鲜、无病虫害的材料。

要选取具有代表性的材料：要按季节和植物生长发育的不同阶段选取材料。 材料大小要适当：太大则溶液不容易渗透，太小则不易操作。一般材料体积限于：0.6cm x 0.4cm x 0.3cm 切取材料要迅速,切口尽量平整。 2．固定的注意事项

要根据材料的不同选择合适的固定剂、固定剂浓度和固定时间。

固定液都以新配为佳，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用；

真空抽气时一定密封完全，否则必影响透明、浸蜡及包埋的效果，材料无法沉底；

固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液；

材料固定完毕后，保存于塞紧或加盖的容器里，同时在容器外上标签，以免相互混淆。 2．脱水注意事项

一定要从低浓度乙醇开始，逐步梯度过度到100%乙醇。 脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分；

在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用枪头吸尽器皿中的脱水剂，然后于容器中加入高一级脱水剂；