河南科技学院生命科技学院本科课程论文
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评分项目 文字表达 综合应用基础理论 与专业知识的能力 学术水平 规范要求 合计（100分） 分值 15分 40分 30分 15分 得分 《花卉中药材快繁技术与生产》2012~2013学年第二学期考核方案A
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香石竹快速繁殖技术研究
摘要：在春、冬季取香石竹的顶芽、茎段芽进行离体培养，研究不同采集季节及部位的外植
体对香石竹芽形成的影响。结果表明：在春季取顶芽做外植体采用70%酒精30 s+0.1%升汞6min消毒处理可获得较好的试管苗。70%酒精30 s+0.1%升汞6 min较适宜于外植体消毒，在春季取材，顶芽分化优于茎段芽，在冬季取材，茎段芽分化优于顶芽。同时对国内一些进展进行一下汇总。
关键词：香石竹；外植体；顶芽；茎段；国内研究进展
香石竹(Diantus caryophyllus)石竹科石竹属多年生草本植物，又名康乃馨。其花朵绮丽、高雅，花色丰富，单朵花期长，在插花、花束、花篮、花环等中都被广泛应用，观赏价值高，与剑兰、郁金香、非洲菊一齐被誉为世界四大切花[1]。我国现已广泛栽培，近年来，随着国外优良品种的引进和栽培技术的逐步掌握，香石竹在中国种植面积成倍增加[2]。内大量生产以满足市场要求，国内外主要采用组织培养进行香石竹的快速繁殖。近年来，多花散枝香石竹正引起人们越来越浓的兴趣，受到消费者的青睐口[3-5]。为了满足市场需要，采用组织培养繁殖是很有必要的，目前已有大量文献报道有关香石竹组培快繁技术，但他们的研究主要以盆栽苗作为材料。该试验在前期研究的基础上，以市场上出售的切花为材料，取其顶芽[6-7]、茎段[7-9] 作为外植体，观察它们在离体培养中的反应，研究不同的取材部位分化形成苗的情况，以期提出采用切花材料作为外植体的适宜采集时间及消毒处理时间。由于切花取材方便经济，研究结果可为利用切花作为外植体进行快速繁殖提供一定的理论基础和试验基础。通过不同种类或不同激素浓度的配比，探讨香石竹的外植体诱芽、继代增殖及生根培养的最适培养基，为短期大量工厂化生产提供参考。
1 材料与方法
1．1 试验材料
从花卉店购买健康、长势良好且花色优美的香石竹花枝作为试验材料。 1．2 试验方法
1．2．1 选择最佳的取材时间
分别在春、冬两季在同一个花店选购由同一家种苗公司提供的香石竹切花。 1．2．2 选择最佳的消毒方法
前期处理：用刀片削取花枝的顶芽或带腋芽的茎段，认真洗刷并在自来水下流水冲洗3 h，
洗衣粉浸泡10～15 min，之后用流水洗净残留的洗衣粉。后期处理：在超净工作台上转入无菌的广口瓶中，采用5种消毒时间处理，即(1)70％酒精20 S+0．1 升汞5 min；(2)70%酒精20 S+0．1 升汞6 min；(3)70%酒精30 s+0．1 升汞6 min；(4)70%酒精30 s+0．1 升汞7 min；(5)70%酒精20 s+0．1 升汞8 min。每个处理中经酒精浸泡后均用无菌水冲洗2次，每次1 min，经升汞消毒后用无菌水冲洗5～6次，每次1 min，处理期间不断摇晃广口瓶，使外植体与消毒剂充分接触，接种到MS+6-BA l.5 mg／L+NAA 0.1 mg／L培养基中，观察外植体存活及污染情况以找出适合最佳消毒方法。
1．2．3 选择最佳的外植体部位
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分别在冬、春季的花枝上选取生长健壮、饱满的顶芽和茎段芽，即从顶端数起前2个芽记为顶芽，其余为茎段芽。在无菌条件下切成1．0～1．5 cm左右长度，经消毒后接种于MS+6-BA 1．5mg／L+NAA 0.1 mg／L中，培养时光强1 400 lx，每天光照12 h，温度(25±2)℃ 。主要观察对比春、冬季材料顶芽和茎段芽的萌发效果，培养7 d后统计污染数(率)、死亡数(率)、萌发数(率)和继代后的增殖数(率)。
2 结果与分析
2．1 不同的消毒时间对各外植体成活率及污染率的影响
在5个消毒处理中，不论是对顶芽还是茎段芽，以处理(3)70%酒精30 s+0．1％ 升汞6 min的消毒时间萌发率最高，均在80 以上，处理(1)的萌发率最低，不到30%；处理(2)、(4)、(5)的萌发率偏低，在38.5％～68.8%，从经济方面考虑，既浪费植物材料又消耗成本，达不到组培的萌发要求，因此不宜作为最佳的消毒处理。而且处理(2)在接种后15~25 d，茎段芽死亡率达85 以上，而顶芽死亡率接近100 。这可能与消毒时间过短，随着培养时间的延长污染进一步显现，处理(4)、(5)在接种20 d内也出现生长不良现象，这可能由于消毒时间过长，对外植体已经造成一定伤害，随着培养时间的延长伤害逐渐表现出来。笔者认为该试验的成活率还比较低，据报道，在使用培养基一致的情况下，香石竹的诱导率可达100 [10]，所以在后续的研究中还有待增加更多的消毒处理以便提高成活率及控制污染率。
2．2 不同季节取材对外植体离体培养成活率及芽诱导率的影响
在相同培养基上进行离体培养不同季节取材的顶芽和茎段芽，其芽诱导率见表2，对于冬季取材来说，茎段芽萌发的瓶数较顶芽的多，茎段芽诱导率为86.7% ，顶芽为81．3％，引起该结果的原因可能是由于顶芽比茎段的腋芽较早形成，此时正值气候寒冷，再加上霜冻等诸多不良天气因素造成顶芽的生理状态比不上茎段芽，相反地，在春季顶芽的诱导率(85．7 )和成活率高于茎段芽的诱导率(83．3％)，分析原因认为春季气温回暖顶芽的生长势优于茎段的腋芽。
3 国内对香石竹快繁的研究进展
3.1 培养条件
肖玉兰等[11]研究发现，在香石竹试管苗的继代培养中，较适宜的培养基为Ms+BA0.2+S50g+ A6.5g,再加上10 000～20 000 lx(太阳光最好)的强度，12 h的光照时间，对消除香石竹继代培养中的玻璃化现象有显著效果。哈梅娟等[12]在防止香石竹试管苗玻璃化问题上，培养适宜温度为25—27℃；光照强度为2 000 lx以上，光照时间为10～12 h；封口材料选择通气性好的材料，如棉塞套牛皮纸。采取这些措施能防止香石竹试管苗的玻璃化。
3.2 培养基筛选
彭信海等[13]通过对培养基的筛选得出MS+0．25 mg／L BA的培养效果较为理想，能使芽的繁殖系数稳定达到5～6倍。并且在MS+0．25 mg／L BA中加入5mg／L多效唑对于减少香石竹试管苗玻璃化现象效果最好。沈宁东等[14]通过研究生长调节剂对香石竹茎尖诱导形成芽的影响得知，最佳的浓度比例为1：2(NAA：6-BA或KT)，最佳组合为0．5 mg／L NAA和1．0 mg／L 6-BA。韩玉琴[15]对康乃馨茎尖培养快速繁殖技术的研究结果表明，适宜的芽增殖培养MS+2.0mg/L6-BA+0.2~0.5mg/L
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NAA+3％糖；生根培养基为1／2MS+0．1～O．5 mg／L NAA。沈宁东等探讨了香石竹试管苗增殖过程中，不同的生长调节剂、碳源、水质对增殖效果的影响，结果表明，在0．5 mg／L NAA和1．0 mg／L6-BA的生长调节剂组合下，试管苗增殖效果好、苗壮，增殖率达4．7。张卫芳等[16]研究表明，在培养基MS+1．0 mg／L 6-BA时，对香石竹诱导芽萌动较好，在MS+0．5mg／L 6-BA+0．1 mg／L NAA的培养基上继代增殖培养效果最好，在MS+1．0 mg／L NAA的培养基上生根效果较好。郑显明等 用聚丙烯塑料袋作为容器对香石竹试管苗茎切段进行液体培养，发现材料生根速度比在固体培养基中快1倍，且根毛发育良好，移栽成活率在90％ 以上。沈宁东等对香石竹试管苗移栽基质进行了筛选，得出蛭石是香石竹试管苗最佳的移栽基质，移栽的平均成活率为86．7％ ，且长势良好。刘丽娜等[17]发明公开了一种适宜香石竹茎段诱导芽的培养基组合物，特别指出MS培养基加0．05～1．20 mg／L6-BA，对茎段诱导芽有效，其中MS+1．0 mg／L 6-BA效果最好，指明了植物生长调节剂6-BA对香石竹茎段诱导芽有促进的作用。施建羽[18]以香石竹茎尖为试验材料，研究不同浓度激素配比对试管苗的生根量及根长的影响，结果表明，试管苗在培养基MS+1．0 mg／L NAA中平均根量最多有33．31根，平均根长最长的是在MS+1．0 mg／L IBA培养基中，达0．47 Cm；生根苗在泥炭：珍珠岩(1：1)中生长最好。
3.2 玻璃化苗
郭达初等[19]探讨了香石竹组织培养系统和玻璃化问题，结果表明，培养基中添加10～15 mg／L CCC或0．5～1．0 mg／L PP 可导致嫩梢矮化、粗壮，减少玻璃化。彭扬等[20]驯采用微茎尖组培技术，大量繁育香石竹无病毒生产用苗株，在增殖培养中选用不加激素的MS培养基、小容积容器及透气封口膜处理容器瓶口，均可有效降低培养过程中的玻璃化株率。周莉娟等[21]用茎尖培养的方法或通过无菌播种，再利用带叶茎段进行快速繁殖试验，并通过调整培养条件寻找克服玻璃化的试验方法，得知，在未出现严重玻璃化之前，适当降低激素特别是细胞分裂素类激素的用量可以减少玻璃苗的出现，但对于已经玻璃化的苗，调整激素用量则收效甚微；增加琼脂用量也有利于控制玻璃苗的出现，一般7．0～7．5 L即可。高疆生等[22]以香石竹为试验材料，通过更换棉塞，增加琼脂浓度，降低6-BA浓度，及在培养基中添加不同浓度的青霉素等方法来克服玻璃化现象，结果表明，这些措施对克服试管苗玻璃化均有效果，尤以添加青霉素效果最佳，正常苗诱导率达95％ 。
3.3 脱毒技术
周丽华等[23]采用茎尖分生组织培养获得无病毒康乃馨植株，以切取茎尖在0．2～0．5 mm较好，热处理对茎尖培养去毒效果也有一定影响。宋瑞琳等[24]对香石竹脱毒技术的研究结果表明，茎尖培养加药物处理，在培养基中加病毒必克2、5、10 ml／L，CaMV脱除率分别达35．7％ 、46．7％ 、61．5％ ；低浓度(2～5 ml／L)对茎尖生长有促进作用，较高浓度(>10 ml／L)对植株生长有明显毒害作用。伊廷双等以带香石竹斑驳病毒的香石竹品种为试验材料，研究了直接剥茎尖法、高温处理结合剥茎尖法和病毒痤处理结合剥茎尖法3种方法在脱病毒效率和茎尖成苗率的差异，结果表明，以加热处理结合剥茎尖法脱病毒效果最好，0．12 mln茎尖脱病毒率可达77．78％ ，加5％病毒痤处理对脱病毒有一定的影响，直接剥茎尖法脱病毒效果最差。
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