植物组培实验报告 实验二、培养基的配制及灭菌

一、 实验目的

1、 熟悉植物组织培养的一般工作流程。 2、 了解培养基的成分、类型及特点。 3、 能正确进行培养基的配制及灭菌操作。

二、 实验原理

植物组织培养是一项技术性强、无菌条件要求高的工作，对场地有一定的要求，需配备必要的仪器设备和器皿、器械，还必须熟练掌握每个环节的操作技术。植物组织培养的一般程序包括拟定培养方案、初代培养、继代扩繁、生根壮苗培养及驯化移栽，其基本操作技术包括培养基的配制及灭菌、外植体的选择与消毒、无菌接种与培养、试管苗生根与驯化移栽等。

三、 实验内容

1、培养基的成分

以MS培养为例，其成分可以分为水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。 １．水

作用：原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中。配制：培养基母液时要用蒸馏水：配培养基时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水。

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２．无机元素

大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃa、Ｍg、Ｓ等。其作用是： (1)N

功能：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命结构和功能物质不可缺少的。

供应形式：含有ＮＯ3－N又含ＮＨ4－N。ＮＨ4－N对植物生长较为有利。在制备培养基时以这两种形式供应。供应的物质有ＫＮＯ3、、ＮＨ4ＮＯ3等。有时，也添加氨基酸。 (2)P

功能：是磷脂的主要成分，而磷脂又是细胞膜、细胞核的重要组成部分。磷也是核酸、ＡＴＰ、辅酶等的组成成分。组织培养中，磷不仅增加养分、提供能量，而且也促进对Ｎ的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。

供应形式：常用的物质有ＫＨ2ＰＯ4或ＮaＨ2ＰＯ4等。

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(3)K��

功能：Ｋ对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系，它具有活化酶的作用。Ｋ增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为１～３mg/l为好。

供应形式：制备培养基时，常以ＫＣl、ＫＮＯ3 等盐类提供。 (4) Ｍg、Ｓ和Ｃa

功能： Ｍg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；Ｓ是含硫氨基酸所构成蛋白质的组成成分。Ｃa 是构成细胞壁的一种成分，Ｃa对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，

供应形式：以ＭgＳＯ4·7Ｈ2Ｏ和ＣaＣl2·２Ｈ2Ｏ提供。

(5)微量元素

种类：指小于0.5mmol/l的元素， Ｆe、Ｂ、Ｍn、Ｃu、Ｍo、Ｃo等。

功能：铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽

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的分化和幼苗转绿有促进作用。Ｂ、Ｍn、Ｚn、Ｃu、Ｍo、Ｃo等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。

供应形式：因其在pH５.２以上，易形成Ｆe（ＯＨ）3的不溶性沉淀，故用Ｆe ＳＯ4·７Ｈ2Ｏ和 Ｎa2-ＥＤＴＡ结合成螯合物使用。 当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。 ３．有机化合物 (1)碳水化合物

供应形式：最常用蔗糖，葡萄糖和果糖也较好，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖也有应用。

使用浓度：２～３％，常用３％，即配制１升培养基称取３０g蔗糖，有时可用２.５％，但在胚培养时采用４～１５％的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。

用量注意：不同糖类对生长的影响不同。以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些；不同植物不同组织的糖类需要量也不同， 代用品：在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。

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（2）维生素

种类：主要有VB1 （盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸) 、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0.1～1.0mg/l。有时用量较高。

功能：以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，促进生长、分化作用。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC有防止组织变褐的作用。 (3)肌醇 又叫环己六醇，

功能：参与构建细胞壁。由磷酸葡萄糖转化而来，进一步生成果胶物质。

肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。促进组织和细胞的繁殖、分化。

使用浓度：一般为１００mg/l， (4)氨基酸

功能：作为有机氮源，利于被细胞直接吸收利用。

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常用种类：甘氨酸，其它如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。

特殊应用：用水解乳蛋白或水解酪蛋白，是牛乳用酶法等加工的水解产物，含有约二十种氨基酸的混合物，使用注意用量在10～1000mg/l之间。否则极易引起污染。

（5）天然复合物 大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。

①椰乳 是椰乳的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在１０～２０％。

功能：它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过１mm时，椰乳就不发生作用。

其它②香蕉③马铃薯④水解酪蛋白⑤酵母提取液（ＹＥ）（０.０１～０.０５％），

4.植物激素 是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。 （1）生长素类

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功能：1诱导愈伤组织形成，2诱导根的分化 3促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，（１０－５～１０－８mg/L）就可促进生长,其次是茎和芽。

性质：天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在体内易受酶解。故常用人工生长素类物质。

配制方法：用少量95％酒精助溶。2，4－D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。配后贮于冰箱中。 IAA（indo acetic acid吲哚乙酸） 来源：天然存在的生长素，亦可人工合成，

性质：是活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被胞中的IAA分解酶和光照降解。 NAA（naphthalene acetic acid萘乙酸） 来源：来自大批量人工合成，

性质：在组织培养中的起动能力要比IAA高出3～4倍， 耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。

作用：NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。

IBA（indolebutyric acid吲哚丁酸）

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来源：人工合成

作用：促进发根能力最强。 2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸） 起动能力比ＩＡＡ高１０倍，

功能：特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。 （2）GA（gibberellic acid赤霉素） 有20多种，培养基中常添加是GA3生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同， 作用：1促进幼苗茎的伸长生长，2赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。3添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。

配制：可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70～100％失效，应当采用过滤灭菌法加入。 （3）细胞分裂素类

性质和种类：是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6－苄基氨基嘌呤）、Kt（kinetin激动素）、Zt（zeatin玉米素）等。 其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。

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作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，避免在生根应用。

生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，

生长调节物质的使用甚微，一般生长素浓度的使用为0.05～5mg/l， 细胞分裂素0.05～10mg/L。 ５．培养材料的支持物 (1) 琼脂

功能：只是固化剂。本身并不提供任何营养。

性质：琼脂能溶解在热水90℃以上中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。

用量：在6～10g/l之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好 质量：一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。

凝固能力：除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。

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固体培养基优缺点：操作简便，通气问题易于解决，便于观察研究等，但培养物与培养基的接触面小，各种养分扩散较慢，

（2)其它 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。 ６．抗生物质antibiotic

种类：抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/l之间。

作用：防止菌类污染， 7. 抗氧化物

种类半胱氨酸及Vc，常用50～200mg/l的浓度，其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。 原理：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。木本植物较严重， 8. 活性炭active carbon

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性质：活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用 使用浓度：通常使用浓度为0.5-10g/l。

作用：1吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5－羟甲基糖醛及激素等。

茎尖初代培养，新梢增殖阶段，活性炭有效， 2 促进生根

其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，

副作用：研究表示，每毫克的活性炭能吸附100毫微克左右的生长调节物质。

2、常用培养基及特点

（1）MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。

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（2）B5培养基 是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

（3）White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了鹏素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。 （4）N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 （5）KM-80培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 3、培养基的配制 课本30—32页有详细介绍 4、 培养基的灭菌 （一）、化学物质灭菌

原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活。使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌。

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常用的灭菌剂：

化学物质名称 有效浓度 化学物质名称 有效浓度 新洁尔灭 0.25% 甲醛 37% 杜灭 0.25% 戊二醛 2% 高锰酸钾 0.1%-0.25% 苯酚 0.1%-0.15% 漂白粉 5% 过氧乙酸 0.02%-0.2%

酒精 75% 焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1% 煤酚皂（来苏尔） 1%—5%

（二）、辐射灭菌

辐射灭菌的原理是利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用的有紫外线、X射线和γ射线。用于室内空气及器皿表面灭菌。

（三）、干热灭菌

灭菌原理是利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时 。适于对玻璃及金属用具及沙土管灭菌。

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（四）、湿热灭菌

灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。水煮常压灭菌：100℃。或饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟。适合培养基和发酵设备灭菌。

（五）、过滤除菌

除菌原理是利用微生物不能透过滤膜除菌。方法是使用0.01~0.45 mm孔径滤膜，用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

四、 实验器材与试剂

1、 材料与试剂

MS培养基母液、植物生长调节剂母液、蔗糖、琼脂、蒸馏水、0.1mol/LNaOH、0.1mol/LHCL。 2、 仪器与用具

天平、酸度计、水浴锅、电磁炉、高压蒸汽灭菌器、量筒、胶头滴管、移液管及移液管架、吸耳球、烧杯、培养瓶、硬质塑料周转筐、铝锅、分装器、标签或记号笔、剪子、镊子等。

五、 方法与步骤

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1、 取母液、称取糖、称取琼脂。 2、 加水四分之三、加热溶化。 3、 定容、调节PH。 4、 分装、封口。

5、 贴标签、高压蒸汽灭菌。 6、 置接种室备用。 7、 填写操作记录。

六、注意事项

1. 实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。

2. 用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放置在小烧杯中称量。

3. 各种母液应保存在2-4℃的冰箱中，以免变质、长霉。 4. 使用高压灭菌锅时，一定要正确操作，并提前检查其中的水是否合适。

5. HgCl2属于一种腐蚀性极强的剧毒物品，配制时要注意安全。

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