思考题： 1、说明细胞电融合的原理． 2、在细胞电融合中，设对细胞产生可逆性电击穿的总能量为Q，如何理解各项电参数之间及其与Q值的关系? 实验结果不是很理想，融合率低。原因可能有一下几点：动物细胞的膜结构比原生质体具有更大的电刺激耐受性，要造成细胞接触点处的膜击穿，需要适当加大各种电融合参数。此外还可在细胞悬液中加入链霉蛋白酶，可改变细胞膜结构，并增强膜活性。 影响细胞电融合因素： 一、用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；二是为了保证融合实验总结 之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80％以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占10—20%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。 在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。 为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质．如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。

细 胞 生 物 学 实验课程教案（9）

实验题目 利用PEG为媒介物进行动物血细胞融合 实验学时 3 实验目的 掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法． 聚乙二醇分子能改变各类细胞的腆结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生实验原理 疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作 用，使细胞发生融合。 实验仪器 离心机、恒温水浴锅、电热套、倒置显微镜 实验材料 鸡 血 细 胞 实验内容与实施过程 备 注 一、溶液配制 1、Alsver液(同前) 2、0.85％生理盐水液 3，GKN液 NaC l8g、KCl0.4g、Na2lOP04·2H201.77g、NaH2P04·H2O0.69g，葡萄糟2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml重蒸水中。 4、50％PEG液 实验前临时配制，根据需要称取定量PEG(Mw=4000)，放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，如做细胞培养融合实验，可用高压蒸汽灭菌30min，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。 二、融合方法 1、取制备的鸡红细胞(制备方法同实验六)悬液lml，加入4min0.85％生理盐水，混匀后以1000-1200r/min离心5min，去上清液后．再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9的生理盐水，其它条件同上。 2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入2—3mlGKN液，混匀后待用。 3、取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2×105个，瘤细胞每毫升含1.5×l0 5个。 4、如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液1ml,加入50%的PEG液混匀，置于30℃水浴内温育lO-15min； 5、用吸管或移液器吸取以上细胞悬液0.1--0.2ml，滴在薄底小培养皿中，利用倒置显微镜进行观察。 三、结果的观察与统计 在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体(homokaryons)，利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体 (heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。 细胞融合率系指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，称为融合率，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。 1.计算融合率？ 2.如何改进该试验，来提高细胞的融合率？请查阅新近的文献。 参考资料 （含参考文献、期刊、杂志等） 实验作业 应用化学融合剂PEG进行细胞融合时，通常以GXN液作为稀释剂，一般使用浓度都在50％左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低．我们的实验证明，有条件如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂，配制成6％--8％的PEG（Mw=000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高． 实验总结 PEG有毒性，提醒学生在操作过程中一定要注意，避免沾上皮肤。