细胞生物学实验课程教案(1) - 2 - 图文 下载本文

思考题: 1、说明细胞电融合的原理. 2、在细胞电融合中,设对细胞产生可逆性电击穿的总能量为Q,如何理解各项电参数之间及其与Q值的关系? 实验结果不是很理想,融合率低。原因可能有一下几点:动物细胞的膜结构比原生质体具有更大的电刺激耐受性,要造成细胞接触点处的膜击穿,需要适当加大各种电融合参数。此外还可在细胞悬液中加入链霉蛋白酶,可改变细胞膜结构,并增强膜活性。 影响细胞电融合因素: 一、用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质,必须满足两个条件:一是为了保持细胞的生物活性,使融合后的细胞能继续存活,并通过培养能继续分裂和分化,其介质要求与细胞本身具有等渗性;二是为了保证融合实验总结 之前所施加的各项电参数充分发挥作用,其介质应具有高纯度的非离子溶液,如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子,将使介质的导电性增加,当施加脉冲波刺激时,据报导,其总能量Q将通过离子的传导作用损失80%以上,而直接通过细胞,用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占10—20%,当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下,将不能保证细胞进行融合。 在介质中有金属离子存在,当施加高频正弦波电场时,不能将细胞极化成偶极子,从而不能使细胞间相互接触和连接,更谈不上细胞间相互融合。 为了解决以上存在的问题,一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质,二是选用适当的非电介质溶质.如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液,另外,在清洗电融合室时,以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。

细 胞 生 物 学 实验课程教案(9)

实验题目 利用PEG为媒介物进行动物血细胞融合 实验学时 3 实验目的 掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法. 聚乙二醇分子能改变各类细胞的腆结构,使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生实验原理 疏散和重组,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作 用,使细胞发生融合。 实验仪器 离心机、恒温水浴锅、电热套、倒置显微镜 实验材料 鸡 血 细 胞 实验内容与实施过程 备 注 一、溶液配制 1、Alsver液(同前) 2、0.85%生理盐水液 3,GKN液 NaC l8g、KCl0.4g、Na2lOP04·2H201.77g、NaH2P04·H2O0.69g,葡萄糟2g,酚红(phenolrad)0.01g,溶于1000ml重蒸水中。 4、50%PEG液 实验前临时配制,根据需要称取定量PEG(Mw=4000),放入刻度试管或刻度离心管内,在沸水浴中加热,使其熔化,如做细胞培养融合实验,可用高压蒸汽灭菌30min,待冷却至50℃时,加入预热至50℃等体积的GKN液,混匀。 二、融合方法 1、取制备的鸡红细胞(制备方法同实验六)悬液lml,加入4min0.85%生理盐水,混匀后以1000-1200r/min离心5min,去上清液后.再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min),如果采用各种瘤细胞,只将洗涤液改为0.9的生理盐水,其它条件同上。 2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞(去上清液)加入2—3mlGKN液,混匀后待用。 3、取以上悬液,用血细胞计数法计数,再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2×105个,瘤细胞每毫升含1.5×l0 5个。 4、如做同种细胞间融合,可取有关细胞悬液1ml,加入50%的PEG液混匀,置于30℃水浴内温育lO-15min; 5、用吸管或移液器吸取以上细胞悬液0.1--0.2ml,滴在薄底小培养皿中,利用倒置显微镜进行观察。 三、结果的观察与统计 在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞,称为同核体(homokaryons),利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞,称为异核体 (heterokaryons),还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。 细胞融合率系指在显微镜的视野内,已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比,称为融合率,通常以百分比表示,而且要进行多个视野测定,再加以平均统计,更为准确。 1.计算融合率? 2.如何改进该试验,来提高细胞的融合率?请查阅新近的文献。 参考资料 (含参考文献、期刊、杂志等) 实验作业 应用化学融合剂PEG进行细胞融合时,通常以GXN液作为稀释剂,一般使用浓度都在50%左右,对细胞的毒性作用较大,虽然在融合后马上进行洗涤,但融合后经过培养阶段,融合细胞的存活率仍然很低.我们的实验证明,有条件如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂,配制成6%--8%的PEG(Mw=000)作为细胞悬液,再按上述条件进行电融合实验,其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高. 实验总结 PEG有毒性,提醒学生在操作过程中一定要注意,避免沾上皮肤。