1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分 细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在 荧光显微镜下观察。 （一）叶绿体的分离与观察 （二）实验结果： ①普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 ②在选用B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 ③加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。 1.在倒置显微镜相连的电脑软件支配下，测量一下叶绿体的长轴和短轴，分实验作业 别测量5~10个叶绿体，求其平均值。 2.在分离叶绿体时应注意些什么问题？ 参考资料 （含参考文献、期刊、杂志等） 实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护实验总结 眼睛，避免紫外线的伤害。 细 胞 生 物 学 实验课程教案（7）

实验题目 细胞器的分离与观察 实验学时 3 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法； 实验目的 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。 差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白实验原理 体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。 密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布实验仪器 若干，无荧光载片和盖片各4片。 0.35mol/L氯化钠溶液 实验试剂 新鲜菠菜 实验材料 实验内容与实施过程 （一）叶绿体的分离与观察 备 注 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分 细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在 荧光显微镜下观察。 （二）实验结果： ①普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 ②在选用B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 ③加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。 1.在倒置显微镜相连的电脑软件支配下，测量一下叶绿体的长轴和短轴，分实验作业 别测量5~10个叶绿体，求其平均值。 2.在分离叶绿体时应注意些什么问题？ 参考资料 （含参考文献、期刊、杂志等） 实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护实验总结 眼睛，避免紫外线的伤害。

细 胞 生 物 学 实验课程教案（7）

实验题目 植物原生质体的分离与培养 实验学时 6 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的条件下，分离的原生质体能够 实验目的 再生细胞壁，进行细胞分裂，并再生完整植株。通过实验，掌握原生质体分离和培养的基本方法，并对培养结果进行观察和分析。 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。 实验原理 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三角瓶、离心管、烧杯、200目不锈钢滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、实验仪器 0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台 烟草幼苗的叶片、新鲜菠菜的叶 实验材料 实验内容与实施过程 备 注