毕赤酵母表达系统

Mut+和Muts

毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别

GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。

其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，

KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型 ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。但仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71中通过取代aox1::ARG4结构来获得His＋转化子。

一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。

基因重组

Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的是防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生。

表达载体主要分为以下几类：(1)胞内表达载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。常用的分泌的信号序列主要是由89个氨基酸组成的α交配因子(α-factor)的引导；(3)多拷贝插入表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K。在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性筛选可能的多拷贝插入，而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

在GS115中筛选His+Mut+转化子：用SalI或StuI线性化质粒转化GS115后，大多在His4位点上发生重组，大多数转化子是Mut+表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生His+Muts转化子，则需要在MD及MM平板上检测可证实His+ Mut+转化子。 线性化酶切位点 插入事件 GS115表型 KM71表型 His+Mut+ His+Muts SalI或StuI 插入his4 SacI 插入5’AOX1 His+Mut+ His+Muts

BglII 取代AOX1 His+Muts His+Muts(不推荐) 毕赤酵母表达常用培养基 10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。 YPD完全培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培养基含 1.5%琼脂)。

转化培养基RDB：每100mL加入山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL。混匀，倒平板(灭菌时只加入 80ml水即可)。

选择培养基MD(最小葡萄糖)：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)。 选择培养基MM(最小甲醇)：配100mL，向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%)。 诱导表达培养基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL。 诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL。 BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解。如果目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MGY、MM)中表达。如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性PH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY。如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。 用考马斯亮蓝G-250测蛋白含量