（8）磁力搅拌器、搅拌磁棒 3.3实验试剂 试剂名称 SDS—PAGE所用试剂 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过硫氨酸 尿素 TEMED SDS DTT 甘氨酸 冰醋酸 甲醇 考马斯亮蓝R-250 低分子量蛋白质Marker 规格 生产单位 100g 100g 100g 500g 100ml 500g 1g 100g 500ml 500ml 5g 14.4-116KDa BBI BBI BBI 广州化学试剂有限公司 Sigma BIO BASIC INC 中科瑞泰生物科技公司 中科瑞泰生物科技公司 广州化学试剂有限公司 广州化学试剂有限公司 中科瑞泰生物科技公司 中科瑞泰生物科技公司 硫酸铵盐析所用试剂 硫酸铵 500g 广州化学试剂厂 4.实验内容 4.1硫酸铵盐析法分离目的蛋白 4.1.1材料预处理

（1）菌体和产物的分离：取6个50ml离心管分别装入琼胶降解菌FG1、FG2、FG3、FG4、FG5、FG6的发酵液，用分析天平平衡离心管，10000r/min，离心10min，取上清液。

（2）粗提物的获取：在（1）中所获取的上清液中加入20%(NH4)2SO4，放入装有碎冰的泡沫箱，静止2h，获得琼胶降解物的粗提物。 4.1.2预实验：硫酸铵盐析最佳饱和度的确定

（1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽上标记20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；

（2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫酸铵晶体末0.171克、0.246克、0.366克、0.468克、0.477克、0.705克和0.843克；

（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中添加1.5ml的粗提物（琼胶降解菌FG），充分振荡使（NH4）2SO4溶解后，在4度下静置12h；

（4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多地去除上清；

（5）添加0.5ml蒸馏水及8μl30%三氯乙酸混匀,静置10分钟后,离心,尽量去除上清；(因此步会造成蛋白质不溶影响后续工作，所以省略) （6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟；

（7）向离心管中添加100μISDS-PAGE上样缓冲液悬浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，取出置-20℃冰箱中备用； 4.2 SDS—PAGE电泳确定目的蛋白最佳饱和度 4.2.1主要试剂 （1)标准蛋白混合液

（2)30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 0.8g,加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。

（3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8,定容100mL。4℃冰箱保存

（4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL。4℃冰箱保存

（5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。 （6)10％SDS，室温保存

（7)质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制)

（8)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。 （9)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸

（10)脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml双蒸水混合 （11)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )

4.2.2实验操作 （1）装板

将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。 （2）凝胶的聚合

分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。

试剂名称 Acr/Bis 30%/ml 分离胶缓冲液（pH8.9）/ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS/ml 10%过硫酸铵/ul 双蒸水/ml TEMED/ul 10%的分离胶 3.3 3.75 0 0.1 50 4.05 5 5%的浓缩胶 0.8 0 1.25 0.1 25 2.92 5 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。

待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。 （3）蛋白质样品的处理

若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20?g的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20?l的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。

吸取未知分子量的蛋白质样品20?l，按照标准蛋白的处理方法进行处

理。 （4）加样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法

用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15?l(含蛋白质10～15?g)，稀溶液可加20～30?l (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 （5）电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约6小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 （6）染色、脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。

5.数据处理和现象记录

5.1盐析现象和数据记录 5.1.1盐析现象

蛋白质盐析后，发现1号离心管基本无絮状沉淀，2号离心管略有沉淀，3、4、5号离心管均有较多絮状沉淀，6、7号离心管底部有很多沉淀并硫酸铵盐过饱和而析出。