生物技术 综合大实验报告

姓 名： 曾奇 学 号： 20112113310056 学 院： 海洋学院 专 业： 11级海洋科学 指导老师： 方再光 日 期： 2014年6月18日

蛋白质的纯化与电泳

1.实验目的

采用硫酸铵盐析法将琼胶降解酶从琼胶降解菌FG1的产物中分离出来，并学习使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE) 测定蛋白质的分子量，使学生学习掌握离心技术和采用盐析法分离目的蛋白技术以及电泳法的基本原理和操作技术。

2.实验原理

2.1盐析法沉淀蛋白质技术 2.1.1盐析法的概念

用盐析法从成分复杂的蛋白质溶液（如细胞裂解液）中提取目的蛋白质是一种传统的目前仍被广泛使用的蛋白质分离纯化技术。盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 2.1.2盐析法的基本原理

蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。上述现象 是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。 2.1.3影响蛋白质盐析的因素

（1）蛋白质溶液中盐的浓度。不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。从成分复杂的蛋白质溶液中分离蛋白质时，盐的饱和度应由稀到浓渐次增加。每出现一种蛋白质沉淀就应将其分离除去后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀出来；

（2）蛋白质溶液的PH值。在蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，因此盐析时应将PH值调节在目的蛋白质的等电点附近； （3）蛋白质浓度。在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易被盐析沉淀。但是浓度太高时，易使杂蛋白共沉淀；

（4）温度。浓盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，因此一般的盐析操作可以在室温下进行。

2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)技术 2.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳的概念和分类

聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）用于分离蛋白质和寡糖核苷酸，是生命科学研究领域重要的分析技术，是蛋白质纯度和浓度分析等实验的常用技术之一。聚丙烯酰胺凝胶电泳有非变性聚丙烯酰胺凝胶和SDS—聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)两种形式。非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳时，蛋白质是完整的，并且根据蛋白质的形状、分子量大小以及其所带电荷量而逐渐呈梯度分开。本次实验所用技术为SDS—PAGE，此技术可以根据蛋白质亚基分子量的不同而将蛋白质分开。该技术最初是Shapiro等于1967年发明的，他们发现强还原剂和离子去污剂在加入到样品介质和聚丙烯酰胺凝胶后，亚基分子量的大小是蛋白质亚基电泳迁移率的主要影响因子（可以忽略电荷因素）。 2.2.2 SDS—PAGE的基本原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，

Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。

3.实验材料及器材

3.1实验材料

（1）琼胶降解菌FG1，由本实验室提供 （2）分析纯硫酸铵：用干净的磁研钵研成细粉末 （3）30%三氯乙酸 （4）SDS-PAGE所需试剂 3.2实验仪器

（1） DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) （2） 电泳仪DYY-4（北京六一仪厂） （3） 长滴管及微量加样器

（4）烧杯(100mL、250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cm?l5cm)、离心管（50mL）、微量离心管（1.5mL）10支 （5）注射器、微量离心管支架 （6）高速冷冻离心机

（7）移液器（1ml、200μL、20μL）、移液枪（1ml、200μL、20μL）