1、设计实验验证美兰染色及台盼兰染色原理上是否存在差异。

答：通过破坏酵母菌中的对美兰的还原酶活性，然后通过用美蓝染色和台盼蓝染色来判断其染色原理的差异。

2、比较詹纳斯绿B与TTC染色结果的差异。

答：詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色；TTC 即2,3,5-氯化三苯基四氮唑，可以用来测定脱氢酶的活性。在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上接受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体膜中，从而使原来无色的线粒体变成红色。细胞活力强，有氧呼吸旺盛，这种转化能力就强，红色深；而死细胞新陈代谢停止不能使四氮唑转变成三苯基甲腙衍生物，细胞不着色。此法常用于悬浮培养细胞等材料整体活力检测（分光光度法），在单个细胞活力检测中较少用。

【实验总结】

通过本次实验，学会了用四种方法染色酵母菌并且观察酵母菌活性的方法。学会了用血球计数板计数酵母菌数量的方法。

实验九

细胞分裂中期纺锤体和染色体结构荧光观察

【实验目的】

1. 学习和掌握细胞免疫荧光染色/细胞转染技术和荧光显微镜使用。 2. 观察有丝分裂过程中染色体和细胞骨架的形态特征和动态变化。

【实验原理】

有丝分裂是高等生物细胞增殖的主要方式。有丝分裂是一个连续的过程，通常人为分为间期，前期、前中期，中期、后期，末期等六个时期。在有丝分裂过程中，细胞核内的染色体通过复制，形成姐妹染色体，在微管形成的纺锤体的牵引下，每一对染色单体分开，并向相反地方向运动，随后胞质分裂，最后形成两个完整的子细胞。通过有丝分裂，细胞形成两个与母细胞完全一样的子细胞，核内染色体经过准确地复制，并有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞保持一致。

在细胞有丝分裂过程中，伴随着一系列事件的发生，比如基因组DNA的复制，染色体的形成，中心体移动到细胞两极，微管组装，纺锤体形成，核仁消失，核膜破裂等等。通过一定的细胞处理，可以将细胞阻滞在某个分裂阶段，再通过染色或标记，就能够观察和研究该阶段的细胞内部结构状态。

【实验方案】

利用免疫荧光染色法观察细胞分裂中期纺锤体和染色体结构 实验用品： （1）仪器

细胞培养间，超净工作台，细胞培养箱，倒置荧光显微镜，低速细胞离心机，水浴锅，冰箱，移液枪。

（2）试剂

高糖DMEM液体培养基，胎牛血清（FBS），0.25%胰酶消化液，PBS，200U/μl青链霉素储备液（P/S），0.2% 秋水仙碱，牛血清白蛋白（BSA），4% 多聚甲醛，75%酒精，Triton X-100，鼠抗α-Tubulin抗体，TRITC-羊抗鼠IgG抗体，DAPI染色液，抗荧光淬灭封片液。

（3）耗材及器皿

1ml, 200μl, 20μl枪头，15ml离心管，1.5ml离心管，12孔培养板，60mm细胞培养皿，圆形或方形盖玻片，载玻片，烧杯。

实验步骤： 1．细胞培养：

（1）Hela 细胞培养

将解冻的Hela细胞转接到60mm培养皿中，加入4mL含有10?S和P/S 的高糖DMEM培养液，置于37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养。第二天显微镜下观察细胞形态。细胞培养液每2天更换一次，将旧液吸出，再加入新鲜培养液。待细胞生长至90%融合时，进行细胞传代。

（2）细胞爬片制备

将盖玻片清洗干净后，浸泡在75%酒精中待用。实验前一天，将处理过的盖玻片放入12 孔板，放入超净台中，用紫外灯进行照射。待盖玻片附着的酒精完全挥发干后，进行细胞接种。

将胰酶消化的Hela细胞接种到放有处理好的盖玻片的12 孔细胞培养板中，接种密度以30-40%融合为宜。再加入1ml新鲜完全DMEM培养液，震荡混匀后，放入37℃ CO2的细胞培养箱中进行过夜培养。或在盖玻片上滴加300μl适宜浓度细胞悬液，放入培养箱中过夜培养。

2. 细胞处理

细胞经过夜培养后，向每孔细胞培养液中加入适量秋水仙碱溶液，使终浓度达到0.2%，震荡混匀后，放入培养箱中进行培养3-5h。以未经秋水仙碱处理细胞作为对照。去除细胞培养液，细胞用PBS洗涤2次，然后用于免疫荧光染色。

3. 免疫荧光染色

（1）每孔细胞加500ul 4% 多聚甲醛，室温固定20min。

（2）去除多聚甲醛，每孔细胞用500 ul含3% FBS或4% BSA 的PBS洗涤3次。 （3）每孔细胞用500ul含0.1% Triton X-100 的PBS在4℃透化处理10min。 （4）去除透化液，每孔细胞用1ml含3% FBS或4% BSA 的PBS室温洗涤5min。 （5）去除洗涤液，每孔细胞加入1ml含3% FBS或4% BSA的PBS，室温封闭30min-1h。 （6）去除封闭液，每孔加500 ul鼠抗α-Tubulin一抗稀释液（抗体用含3?S或4% BSA的PBS进行适宜稀释），室温孵育1h或4℃过夜。

（7）去除一抗，每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（8）每孔细胞加500 ul 带有TRITC（罗丹明）荧光标签的羊抗鼠IgG二抗稀释液（二抗同样用含3?S或4% BSA的PBS进行适宜稀释），室温孵育30 min-1h。

（9）去除二抗, 每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（10）去除洗涤液，每孔细胞加入少量适宜DAPI染色液，覆盖样品即可，室温孵育3-5min。

（11）去除DAPI染色液，每孔细胞用1ml PBS洗涤3次，每次5min。

（12）在载玻片上滴一小滴抗荧光淬灭封片液，将盖玻片从培养板中取出，面朝下盖到抗褪色剂上，使其轻轻接触到载玻片上。可在盖玻片周围滴几滴指甲油，以固定盖玻片。将玻片置于暗处5min使其晾干，然后在荧光显微镜下进行观察。

4. 染色体和纺锤体荧光观察

将制备好的样品放置在倒置荧光显微镜的载物台上，先用低倍镜在明场中找到细胞，观察细胞形态。然后打开汞灯，选择适宜滤光片，观察荧光标记的染色体和微管形态和结构。（经DAPI标记的染色体呈紫色，最大激发波长364nm，最大发射波长454nm。 经TRITC标记的微管呈橙红色，最大激发波长550nm，最大发射波长620nm）。

【实验方案】

1、现象观察：在显微镜下能够观察到海拉细胞的纺锤体心态。 2、图片

见图9.1