2、根据M-缓冲液的成分，分析其作用。

答：咪唑：稳定PH值，缓冲作用。KCL：提供离子，对骨架起聚合作用。MgCL2:提供离子，对骨架起聚合作用。EGTA：螯合Ca2+，Ca2+对聚合不利。巯基乙醇：起还原作用，稳定骨架结构。

【实验总结】

通过本次实验，掌握了制作植物细胞骨架装片的方法。同时，在显微镜下观察到了细胞的骨架结构，对微管、微丝、中间丝有了更形象而具体的认知。

实验六 PEG法诱导细胞融合

【实验目的】

1. 了解细胞融合的原理和过程；

2. 初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。

【实验原理】

细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。

化学融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进行融合。商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞融合剂。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得融合体，融合效果好。

细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。

【实验用品】

1．器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。 2．材料：鸽血悬液； 3．试剂：

1）0.85%的生理盐水； 2）GKN液：8.0g的NaCl，0.4g

50%（m/V）PEG（37℃温浴）：取50gPEG（相对分子质量＝4000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置37℃备用。

3）1%詹那斯绿B；

4) Hanks溶液（含NaCl，KCl, Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚红） Hanks原液（10×） NaCl 80.0g Na2HPO4·12H2O 1.2g KCl 4.0g KH2PO4 0.6g

MgSO4·7H2O 2.0g 葡萄糖 10.0g CaCl2 1.4g

称取1.4g的CaCl2，溶于30～50ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按照上述配方水需，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可放入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已经溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000ml。 Hanks液：

Hanks原液 100ml 重蒸水 896ml 0.5％酚红 4ml

配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。

【实验步骤】

1.鸽血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:3~1:4的比例稀释，制成鸽血红细胞细胞悬液，放入4℃冰箱内可保存3--4天；

2.取鸽血1ml，加入4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操作一次；

3.沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液，用Hanks溶液稀释沉淀，制成10%左右的细胞悬液，迅速在显微镜下观察细胞密度；

4. 取1ml上述细胞悬液，加0.5ml 50% PEG溶液，37℃水浴中进行细胞融合（30min左右）； 5.缓慢加入Hanks溶液，轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来（镜检），室温静置约20min;

6.取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右； 7.镜检，观察细胞融合现象。

【实验结果】

1、现象观察：在普通光学显微镜下观察到某些血细胞融合，但有些血细胞呈现假融合现象，即是仅仅细胞膜相互贴紧，没有完全形成细胞之间的融合现象。 2、图片

见图6.1、图6.2 【作业与思考】

1、请分析Hanks溶液的作用是什么（可以从其成分的角度来回答）？

答：Hanks液主要作为合成培养基（液）的基础液以及用于洗涤组织、细胞等。

一般我们需要提取组织中的某种细胞，必须使组织解离分散，然后才能分离细胞，这时就需要用hanks液漂洗组织。其中的Na2HPO4起到了缓冲液的作用，同时

Hanks溶液还能终止PEG的融合反应。

2、PEG诱导细胞融合率受哪些因素影响？

答：温度，时间，peg体积分数。

3．你认为在进行细胞融合时，要注意哪些问题?

答：⑴PEG的分子量与浓度：细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2、PEG的pH值：经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3、PEG的处理时间：处理时间越长，融合效果越好，但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养，故处理时间可适当放宽至数分钟。4、融合时的温度：由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果，在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细，一般采用的温度为38~40℃。5、注意区分融合细胞与重叠细胞，此次试验观察到较多细胞聚集成团，可能是细胞悬液浓度略大或滴的量不合适所致。

【实验总结】

通过本次实验，初步掌握了利用PEG的化学药剂法融合鸽血细胞的方法，但是由于操作技术不熟练，导致某些细胞融合不成功，仅仅是细胞表面贴紧在一起，呈现假融合的现象。