颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

【实验总结】

通过本次实验学会了分离叶绿体的方法，但是对于撕取菠菜叶表皮也观察完整叶绿体的这个操作不甚熟练，操作技术仍需要加强。另外本次实验的一个失误就是将离心机的转速设置过高，导致在显微镜下观察到的叶绿体形态大都破裂了。

实验四 吖啶橙(acridine orange)染色

观察口腔上皮荧光

【目的要求】

1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。 2、观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。

【实验原理】

吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。

【实验用品】

1．器材：荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签； 2．材料：口腔黏膜上皮细胞临时制片； 3．试剂:

1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。

A液：NaH2PO4·H20 2.76g加蒸馏水至100ml； B液，Na2HPO4·7H20 5.36g加蒸馏水至100ml；

取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml。

2)0.1％吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。临用时配制0.01％吖啶橙染液：将0.1％吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀释。

3）95％乙醇

【方法与步骤】

1．用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上； 2．95％乙醇溶液固定5min； 3．滴加0.01％吖啶橙染液染色5min； 4．用PBS缓冲液缓慢冲洗； 5．加盖玻片镜检。

【实验结果】

1、现象观察：在显微镜下可以观察到呈黄色或橙黄色的口腔上皮细胞。 2、图片

见图4.1、图4.2

【实验总结】

通过本次实验学会了刮取口腔黏膜上皮细胞并制作临时装片的方法，学会了使用丫啶橙染色的方法。

实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察

【实验目的】

掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜观察洋葱内皮细胞的骨架网络结构。

【实验原理】

细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本实验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

【实验用品】

1.器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯； 2.实验材料：洋葱鳞茎； 3.试剂：

1） pH6.8的磷酸缓冲液； 索伦森（Sorensen）磷酸缓冲液

溶液A：Na2HPO4·2H2O 11.876g加蒸馏水至1L 溶液B：KH2PO4 9.08g加蒸馏水至1L

对照下表取一定体积的溶液A，再加入足够的溶液B至总体积达100ml，即得到所需pH的缓冲液。 溶液A 0.6 2.3 4.9 12.1 26.4 pH 4.9 5.3 5.6 6.0 6.4 溶液A 49.2 61.2 67.0 72.6 77.7 pH 6.8 7.0 7.1 7.2 7.3 溶液A 81.8 85.2 88.5 93.6 96.9 pH 7.4 7.5 7.6 7.8 8.0 2）M-缓冲液 ：50mmol/L (pH 6.7)咪唑、 50mmol/L KCl 、 0.5mmol/LMgC12 、 1mmol/L EGTA 、0.1mmol/L EDTA 、 1mmol/L巯基乙醇、 4mmol/L甘油 、1mol/L HCl 调pH 至7.2。

3）1%TritonX-100：用M-缓冲液配制。 4）3%戊二醛：用pH6.8的磷酸缓冲液配制。

5）0.2%考马斯亮蓝R250 染液：0.8g考马斯亮蓝R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸 、46.5ml蒸馏水。

6）50％，70％，95％乙醇

7）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶

【实验步骤】

1. 取材：撕取洋葱鳞茎内表皮0.5～1cm2，浸入装有磷酸缓冲液（PH6.8）的小烧杯中，

处理5～10分钟。

2. 去垢处理：弃去PBS缓冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，

使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃恒温箱或水浴锅中处理30分钟。 3. 冲洗：吸去1%Triton X-100，立即加入M缓冲液轻轻冲洗3次，每次3～5分钟。 4. 固定：用吸管将M缓冲液吸尽，加入3%戊二醛，固定10～20分钟。

5. 冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗3次，每次3～5分钟。 6. 染色：吸去PBS缓冲液，加入适量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色10～20分钟。 7. 制片：吸去染料，用水冲洗（注意不要将材料丢失）。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片

上，加盖盖玻片。

8. 镜检：将制好的片子置于低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，

细胞质内可见到被染成蓝色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜继续观察，调节细螺旋可见到细胞骨架的立体结构。

在有样品的50ml烧杯中，顺序通过如下药物：50％、70％、95％乙醇，95％乙醇＋叔丁醇（1：1），叔丁醇（每级5～10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每级5～10分钟），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的可加一滴中性树胶，盖上盖玻片。

【实验结果】

1、现象观察：在普通光学显微镜下可以观察到亮蓝色细胞骨架结构。 2、图片

见图5.1 【作业与思考】

1、绘出洋葱细胞的骨架网络分布。 答：见图5.1