防冻剂：在冷冻条件下采用一些中性溶质试剂等，可明显的增强生物组织的抗冷能力，这类植物在抗冻生理学上被称为“防冻剂”。

常见有两种：一类为渗透性防护剂，有二甲基亚砜、乙二醇酰胺、丙二醇、甘油等。 另一类为非渗透性防护剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇（PEG）类。

防冻剂的作用原理：①渗透性冷冻保护剂多属于低分子量的中性物质，容易与水分子结合，发生水合作用，从而增加溶液的粘度，降低溶液的冰点，减弱水的结晶过程，即冰晶中心增长速度下降，消弱了水的固化程度，故在冷冻与解冻过程中，培养基及细胞内的冰点降低，从而保护了植物材料。②由于冷冻剂的加入，培养基的渗透压提高，使细胞产生轻微的质壁分离，增加了细胞的耐寒能力。③二甲基亚砜等极易渗入细胞内部，从而防止在冷冻及融冰过程中细胞过度脱水而受到破坏。④非渗透性防冻剂在特定的温度下可降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护材料的作用，对细胞膜具有一定的保护作用。

四、超低温保存的步骤

1、植物材料的选择

茎尖、幼胚、幼苗：处于旺盛的对数分裂期，细胞质浓厚，抗冻能力强。已有17个属50余种植物进行茎尖分生组织的超低温保存。 分生组织的优点：

（1） 在某些情况下，愈伤组织难以形成完整的植株，分生组织容易些； （2） 遗传更稳定；

（3） 更快的营养繁殖方式； （4） 产生无病毒植株；

（5） 可经受突然地冷冻降温。

悬浮细胞及愈伤组织：培养代数越多，会使细胞失去再生的潜力；培养时间过长会使细胞液泡化。应选择代数少，继代周期为5~7d的材料。

原生质体：没有细胞壁受伤害较少，可筛选出抗性强的细胞株系，但操作技术难度大，成功者较少。 2、预处理 常用的方法：

（1）低温预处理 将植物材料放于0℃左右处理数天至数周，低温敏感的材料。 （2）加入渗透剂：如甘露醇、山梨醇、蔗糖

（3）加入二甲基亚砜 预培养24~48h，或0~60min 注意毒性，浓度不宜超过5%。 （4）将培养细胞适当脱水，可提高解冻后的存活率。 3、冷冻

一般在-20-60℃范围内冰晶中心增长最快，后转慢到-140℃完全停止。

冷冻的方法一般有 慢速冷冻、快速冷冻、逐步冷冻、干冰法、包埋脱水、玻璃化法、利用驯化法。 （1）慢速冷冻：将加入冷冻保护剂的材料，以0.1-10℃的速度逐渐降低其温度，待降至-40℃或-100℃时，

慢慢进入液氮中储存。

优点：慢速冷冻通过细胞外结冰，使细胞的水分较少到最低限度，既对冷冻细胞有脱水作用又防止细胞内冰晶的形成，避免冰冻伤害。

适合于液泡化的细胞，以保存成功。 缺点：需要程序降温仪，技术系统昂贵。 （2）快速冷冻法

经冷冻防护剂处理的样品直接转入-196℃的液氮罐或液氮库中。 优点：使细胞内水分迅速通过冰晶形成的危险温度（-140℃—-10℃），使细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到-196℃的安全区。此时细胞内的水分为玻璃化状态，对细胞结构不产生破坏作用，减轻或避免细胞内结冰。

适合于种子花粉、球茎或块根等。如康乃馨、草莓的茎尖超低温冷冻时，先逐渐冷却到-15℃后直接投入液氮中，几乎所有材料都存活。 （3）预冷冻法

又叫逐步冷冻，将冷冻剂处理过的植物材料逐渐冷却（冷却速度1℃/min）或分部冷却（约5℃/min）

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至-30~-50℃，停留约30min，使材料脱水，然后投入液氮中。

对于茎尖和芽的冷冻最为有效。

在烟草、萝卜、长春花、水稻、玉米等悬浮细胞、愈伤组织获得成功。 （4）干冻法

将培养的材料通过一定的脱水后再投入液氮中。

常用的脱水方法有：真空干燥法、烘箱、烘干、硅胶干燥、含高渗浓度渗透性化合物中培养。 真空干燥法最好。

橡胶树新鲜胚轴含水量为55%，经3h脱水处理后，降至16%，冷冻保存后存活率达到67%。 （5）包埋脱水法：

将培养材料由褐藻酸盐包埋成球状颗粒，在含高浓度蔗糖溶液中预培养几天，经无菌空气或硅胶部分脱水，进行快速或慢速冷冻。 （6）玻璃化法

指完全玻璃化保存，将培养的材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮。使保护剂和细胞内水分来不及形成冰晶，使培养材料连同保护剂都进入一种人工的完全玻璃化状态，是一种透明的“固态”。

效果：在此玻璃状态中，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因而不会由于细胞内结冰造成机械损伤或溶液效应、伤害组织和细胞，保证化冻后细胞有活力。

液体的固化两种形式：一种是降温不够快易形成尖锐的冰晶。

另一种是进入无定形的玻璃化状态，只要能使温速度下降的足够快，任何液体都可进入玻璃化，这种温度叫做玻璃化形成温度（Tg）。

克服方法：一是使用高浓度的保护剂，即玻璃溶液；二是增加静水压力，两种方法均可使均一晶型形成的温度下降，玻璃化形成温度降低，产生稳定的玻璃化。

但高浓度的保护剂和高的静水压对细胞是有害的。

保护剂的选择：大部分的低温保护剂都可作为玻璃化永夜的成分。二甲基亚砜形成玻璃化能力较好，对细胞渗透快，毒性低，是较好的玻璃化材料。多种在植物冻有玻璃化冻存研究中获得成功。

玻璃化的保护剂：Sakar(1991,Jappan)研制出的保护PVP2（30%甘油+15%DMSO+0.4mol/l蔗糖+MS-NH4+ ）无激素培养基。

玻璃化法优点：设备简单和操作程序简单，不需要程序降温仪和冷冻器；可冻存较大的组织和器官；效果重演性好；克服传统低温保存的不足之处。 4、贮存：

关键要把冷冻温度维持在-196℃下，不发生温度的波动。一般认为在-196℃温度下，冰晶不会增长及重新形成。 5、解冻：

两种方法：快速解冻法和慢速解冻法

快速解冻法：即把液氮超低温冷冻的材料直接放入35~40℃的水浴中解冻，一般约1~2min。快速解冻，可防止组织和细胞的脱水死亡，也使冷冻的材料快速通过细胞及组织形成冰晶及冰晶增长的危险温度。

一旦并完全熔化，应迅速移开材料，防止热伤害及高温下保护剂的毒害。

慢速解冻法：即在0℃、2~3℃或室温下进行解冻，易使细胞重新形成冰晶，应用较少。需在冷冻前把细胞的含水量降到一个适当的水平，该方法多用于脱水材料的解冻。

六、植物细胞存活力测定

再培养：解冻后的材料再在培养基中培养，观察生长情况，判断死活。 存活率（%）：重新生长的细胞数（器官数）/解冻的细胞（或器官数）x100%。 荧光素双醋酸酯法（FAD）

七、提高冷冻后细胞或组织存活率的方法

1、材料的选择：综合考虑植物材料的大小、基因型、抗冻性、年龄、形态结构生理状态。

保存的大小：茎尖一般为0.3~0.5mm长、待1对叶原基。 细胞：选择细胞质浓厚的分生组织。幼龄的细胞。

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2、冷冻前预处理

（1）悬浮细胞或继代培养：使细胞同步化

（2）预培养：增加培养基的蔗糖浓度，提高渗透压，或添加ABA等 （3）低温锻炼：

3、超低温保存方法的选择：选择合适的方法。 4、冷冻保护剂的选择

第三节 低温保存技术

1 概念：将种质用离体培养的方法储存在非冻结程度的低温下（1~9℃），但热带亚热带植物。

在10-20℃也能延缓生长，叫低温调控生长。

在1-9℃下 ，植物材料的生长速度减慢，但不完全停止，因此需对材料进行继代，间隔时间可延长，达几个月或几年。

优点：在这样的温度下，长期保存，方法简单，存活率高，只需常温继代下，即可迅速恢复生长，移栽葡萄、草莓、柑橘、苹果、悬钩子中应用。

结合化学和物理的方法：低温保存化学与核物理方法结合，更有助于延长植物的保存时间。 加入生长延缓剂：ABA、多效磋等。 低温低氧处理

2 常温保存：在20℃左右，应用物理或化学的方法，改变培养基的成分环境或延缓培养物生长，达到终止

保存的目的。

培养基中加入延缓剂：ABA、CCC青鲜素、B9等

提高培养基的渗透压：蔗糖浓度提高到10%，也可用于甘露醇。 降低培养瓶中氧分压： 3 培养物干燥保存：

把胡萝卜体胚放在滤纸上，置于空气流动的无菌箱中风干4~7天，保存在附加生长抑制剂的培养基中，可达来能够年之久。

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