二、原生质体活力鉴定

（1）观察胞质环流 生活细胞活跃代谢的标志，用于原生质体活力的检测。不适合细胞内含有大量叶绿体的叶肉细胞就很难观察胞质环流现象。

（2）伊蓝染色 有活力的原生质体，不为伊蓝着色。

（3）氧电极测定氧呼吸 指示原生质体呼吸代谢，用氧电极指示呼吸强度。 （4）荧光素双醋酸酯法（FDA） 荧光素双醋酸酯法（FDA）的原理

FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。

在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。

第四节 原生质体的培养与植株再生

一、原生质体培养方法

1、液体浅层培养方法：将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一层，封口后进行培养。 2、液体微滴培养：用滴管将原生质体加在培养皿底部中培养。 3、琼脂糖珠包埋 4、液固双层培养

二、影响原生质体培养因素

1、原生质体质量

2、培养基组成：常用KM8p

降低培养基中铁、锌、铵态氮用量，有利于原生质体培养。

如把MS培养基中铁盐浓度降低10倍，可大大增加原生质体存活和分裂数量；

相反提高培养基中的Ca^2+含量（2-3）倍，有利于细胞壁再生，和提高细胞分裂的频率。 有机氮：如水解酪蛋白和谷氨酰胺，对细胞壁的再生、分裂、生长都有重要的作用。 激素：生长素和细胞分裂素是原生质体培养中不可缺少的。

附加物：添加椰子汁酵母提取物、麦芽浸膏等有利于原生质体的生长。 多胺：

3、原生质体的植板密度

都采用1x104-1x105/ml之间。低于104/ml细胞不能持续分裂。

高密度下，个别原生质体系聚集成的细胞团较早交错在一起，若是异质的，则会形成嵌合体。 KM8p培养基可在低浓度下培养原生质体。 4、渗透压和PH值

一般培养基浓度在0.37-0.7mol/l之间，在这样的高渗条件下，可避免培养基的原生质体破裂。 可加渗压稳定剂。PH值一般在5.6-5.8。 5、培养条件

在开始时要求在黑暗或散射光下培养，当形成愈伤组织，则要加强光照直至分化出小植株。 环境湿度：高湿度的容器 培养温度：一般为25-26度 照光时间：10-12h

三、植株再生

原生质体—细胞壁再生—细胞分裂—细胞团—愈伤组织—分化培养—再生植株 1、器官形成再生植株：多数通过器官再生，需3种不同的培养基

（1）原生质体培养基：保证新壁产生及细胞分裂，形成团及愈伤组织。

（2）分化培养基：要求去掉渗透稳压剂，降低生长素水平，提高分裂素水平，有利于不定芽分化。 （3）生根培养基：加入生根培养基中进行生根，有求去掉分裂素，加低浓度生长素

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2、体细胞胚再生植株：多集中于禾本科、伞形科、芸香科、葫芦科以及裸子植物中。

关键因素：原生质体形成的愈伤组织家2,4-D的诱导培养。 发育方式：（1）形成细胞团直接产生体胚（直接再生）如油菜、苜蓿等

（2）原生质体经愈伤组织诱导产生体胚（间接再生）如大豆未成熟子叶 四、原生质体再生植株的遗传特性

（1）染色体和数量变化

叶肉、茎尖、胚性组织等细胞分离得到原生质体的保持原有的胚性；倍性变化的物种长期无性繁殖的物种、及悬浮细胞长期培养 得到的原生质体倍性和体、染色体数目较易变化

（2）原生质体再生植株的性状变异

在形态和性状方面的变异如马铃薯筛选出

第五节 原生质体融合

体细胞杂交：在植物中将原生质体融合，为克服有性杂交不亲和、打破物种之间的生殖隔离、扩大遗传变异等提供有效手段。

包括：原生质体得的制备、原生质体融合、杂种细胞的选择、杂种细胞培养、杂种植株的再生及杂种植株的鉴定等。

一、原生质体的融合

3个阶段：1）凝集作用阶段：2个原生质体彼此相互靠近；2）靠近的原生质体在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈连续状态，或出现桥；3）连续的细胞质区域扩大，融合完成，形成球形的异核体或同核体。

二、原生质体融合方式：

1 自发融合 去壁的原生质体具有彼此融合的能力，在制备原生质体酶解保温的过程中，相邻的原生质体酶解保温的过程中，相邻的原生质体彼此融合形成多个细胞核的融合体

注意:一般采用一步法制备的原生质体比两步法多，自发融合也比较常见。 降低融合的方式：利用两步法制备的原生质体在酶解保温之前先使细胞经过强烈的质壁分离药物处理，切断细胞之间的胞间连丝，减少自发融合的频率。

2 诱发融合 在体细胞杂交过程中，自发融合是无意义的。一般要求融合的原生质体时不同来源地，需要融合剂诱发原生质体的融合。

（1）NaNO3处理：诱发可重复控制的离体原生质体的融合，获得体细胞杂种。

但在异核体频率不高，尤其在高度液泡化的叶肉 （2）高PH值-高浓度钙离子处理：

Keller和Melchers（1973）研究出的一种将Ca2+同高PH相结合方法即高PH-高Ca2+融合法。 原理:植物原生质体正电荷，表面电荷因物种不同而不同，变动与-30~-10mv之间。由于所带电荷性质相同，彼此聚集的原生质体膜并不十分接近到足以融合的程度。

原生质体融合法发生的条件是：膜的贴近程度必须相当于分子距离1nm或者更小。 高PH值-高浓度钙能够中和正常的表面电荷，因此可使聚集原生质体的质膜紧密接触。 0.01mol/l的CaCl2.2H2O能够完全除掉烟草原生质体的电荷。 高PH值-高浓度钙离子处理具体做法:

将两个原生质体的混合物放于含0.05mol/lCaCl2.2H2O和0.4mol/l甘露醇（PH10.5）的溶液中，200r/min； 低速离心3min，将离心管保持于37℃水浴锅中40~50min,可使20~50%原生质体融合。

注意事项：

（1）Ca2+浓度非常重要。且因植物种类不同而不同。

烟草中低于0.03mol/l原生质体很少聚合；当浓度为0.05mol/l，融合效果最好。 （2）PH值也受植物种类的影响。

烟草中8.5~9.0时可见原生质体融合，但效率不高； （3）PEG融合法：

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由Kao与Michayluk（1974）建立。

诱发大豆与大麦、大豆与玉米、野豌豆与豌豆原生质体融合获得成功。 具体方法：

两种不同的原生质体昏昏然，用28%~58%的PEG（分子质量为1500~1600）溶液处理15~30min,将原生质体用培养基逐步清洗即可培养。

PEG融合法优点：双核异核体的形成频率高，重复性好，对大多数细胞类型来说毒性较低。如Burgess与Lleming报道，产生的聚集体很大，每个聚集体中包含多个原生质体。

而用PEG溶液处理时多数聚集体只包含两三个原生质体。且诱导的融合没有特异性，可使任何两种原生质体融合在一起，即能使植物原生质体间融合，也能使植物-动物、动物-酵母原生质体间融合。

或着用：30%PEG6000，0.01mol/l的甘露醇（PH9.0）融合液直接融合，也可得到较好效果。

PEG法融合原理：有人认为由于PEG分子具有轻微的负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质、糖水化合物形成氢键。当PEG分子链大到足够程度时，它在相邻的原生质体表面之间而使其能够发生粘连。

（4）PEG-高PH值-高浓度钙融合法：

用含有高Ca2+浓度（0.05mol/lCaCl.2H2O）的强碱溶液（PH9~10）清洗PEG，比用培养基清洗时能产生更高的融合频率。

具体做法：2种原生质体混合，用吸管滴于培养皿底部，形成小滴状；在小滴上及周围滴加PEG溶液，处理10~30min,使原生质体粘连融合；用高Ca2+浓度高PH溶液清洗PEG，再用培养基洗去高Ca2+浓度高PH溶液。

或者用：30%PEG6000，0.01mol/LcaNO3.4H2O和0.5mol/l甘露醇（PH9.0）融合液直接融合，也可得到较好效果。

PEG-高PH值-高浓度钙融合法优点：对植物原生质体来说是最好的方法，如豌豆-大豆的原生质体融合中，该法的形成率达50%，而单独用高Ca2+浓度=高PH法只形成4~5%的异核体。

PEG诱导植物原生质体融合受到以下因子的影响：①PEG分子量②原生质体密度③温度。 3、物理融合法——电融合法

从20世纪70年代末到80年代初发展起来的。 具体做法：

（1）将分离得到的原生质体用0.5mol/l的甘露醇溶液（可同时加入0.001mol/lCaCl2.2H2O）洗涤1次，1200r/min,4min离心；

（2）收集原生质体调原生质体密度至2~8x10^4个/ml，适当比例混合两亲本的原生质体

（3）将混合原生质体悬浮液滴入电融合小室，先给两极以交流电流，使原生质体沿着电场方向排列成串珠状，接着就给以瞬间的高强度的电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合。

（4）电融合处理后，将融合产物移入培养基中，可直接进行培养。 影响电融合的因素：

高PH值-高浓度钙能够中和正常的表面电荷，因此可使聚集原生质体的质膜紧密接触。0.01mol/l的CaCl2.2H2O能够完全除掉烟草原生质体的电荷。

原生质体密度：电极液中CaCl2.2H2O浓度；交变电流的强弱，电脉冲的大小及脉冲期宽度与间隔等。 电融合的优点：

（1）：操作方便、快速、融合同步性好，可在小微机概念下观察全过程，整体过程各种参数较易控制。 （2）一次可融合大量的原生质体，特别适合大量融合研究；

（3）融合产物多数只包含2个或3个原生质体，在各种参数适宜的情况下，还可进行特异融合； （4）电融合不使用任何溶剂，无任何毒害作用，因而融合细胞无需重复洗涤，可直接英语培养。 电融合缺点：需要昂贵的电融合仪，因而不太广泛。

思考题：

1、原生质体的融合方式有哪些？ 2、钙在原生质体融合中有哪些作用？

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3、电融合的优缺点有哪些？

第八章 种质保存

第一节 种质保存的概念及意义

传统方法有:种子保存和种质保存

种子保存:虽占空间较小,且能保存多年,但贮藏过程中获利下降或失活,病虫害危害,又是杂合体,繁殖中性状会出现分离.

种质种质:是指植物亲代通过生殖细胞或体细胞传递后代的物质.

植物种质资源:携带各种不同遗传物质的植物总称,是资源考察、搜集、保存及开发利用以及科学研究的基础。

植物种质保存：指利用天然的或人工创造适宜环境，来保存种质资源，保持其哟传特性和生命力的技术。

植物种质保存有三种方式：就地保存、迁地保存、

就地保存：通过建立保护区、森林公园来实现种质保存目的。 迁地保存：建立植物园、种质资源圃、种质库、离体保存 植物种质离体保存：采用组培技术，保存业已建立再生体系的恩赫一种植物的多种培养物 如：单细胞、原生质体、愈伤组织、悬浮细胞、花、花粉、胚、分生组织及试管苗的方法。

植物种质离体保存方法：超低温保存和低温保存 种质保存意义：（1）长期保持种质的遗传稳定；保持细胞形态发生的能力；保存珍惜及濒危植物的种质资

源；保存不稳定性的培养物 如单细胞；长期储存病毒的种质；防止种质衰老；延长花粉寿命。 （2）节约大量的土地及人力物力、节省费用

（3）不受病虫害的侵染，便于国际种质交流，一旦需要，可迅速通过则配技术进行快速繁殖。

第二节 超低温冷冻保存技术

一、 概念及应用

超低温：是指低于-80℃（干冰温度）的低温，主要是液氮（-196℃）及液氮蒸汽相条件。

超低温保存：液氮（-196℃）下是保存的货细胞的物质代谢和生长活动几乎完全停止。

优点：既能保持生物材料的遗传特性，也不会丧失其形态发生的能力，比种子保存节省人力物力，防止变异。

应用：植物细胞体积大，液泡化程度高，对冷冻极敏感，保存技术难度大。

保存材料：离体培养的原生质体、细胞、组织、器官、小植株、花粉、蕨科植物的孢子等

二、超低温保存的原理：

超低温保存时，降温冷冻和化冻过程最易引起植物材料的伤害。 冷冻受害的原因：在降温冷冻过程中，植物组织活细胞遭受冻害。

（一）是细胞内部结冰：如果有机体细胞内的水分发生结冰就会造成细胞结冰的破坏，导致死亡。 （二）是细胞内溶质的浓缩：由于细胞质最初是高渗透压的，故一般先导致细胞外结冰，这便增加了细胞外细胞溶液的浓度，从而导致细胞膜内外的渗透压梯度发生反转，即发生细胞失水，并逐渐变为脱水状态，细胞溶质发生浓缩。

细胞收缩超过临界值时，引起蛋白质相互靠近，造成细胞的损伤。 防止发生冻害的方法：

慢速降温可使细胞内的水不断流到细胞外结冰；细胞内的水来不及流到细胞外而造成胞内结冰。

在就爱那个吻冷冻过程中创造一个适宜的条件，使植物材料发生保护性脱水u，植物就不会发生冻害。 冬季的植物材料，经过抗寒锻炼已经发生保护性脱水及其他提高抗寒力的变化，所以采用冬季植物材料超低温保存容易获得成功。

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