分为一倍单倍体、多倍单倍体。

二、 单倍体细胞的历史

1、 Tulecke（1950）：首次成功地培养科数种裸子植物成熟的花粉粒，大部分花粉可发育成成熟地花粉，另

一些发育愈伤组织。

2、 Yamada(1963):首次报道优紫露草属植物的花药中分离得到了单倍体组织。 3、 印度地Guha和Maheshwari（1964）

成功将曼陀罗成熟的花药培养在适当的培养基上，发现了花粉能转变成分裂状态，从药室转化中长出了胚状体，获得单倍体植株。 4、 我国单倍体育种

1971年中科院遗传所对水稻的花药培养获得了水稻幼苗，在小麦培养中获得单倍体植物。 5、 花粉培养

始于1953年，Tulecke诱导了银杏的花粉获得愈伤组织。另外在天仙子 颠茄、小麦等获得花粉植株。

6、 该技术在10个科、24个属、34个种的250种植株上达到了发展。

三、 花药、花粉细胞培养的应用价值

（1） （2） （3） （4） （5）

在植物育种中使后代迅速纯合 单倍体选择效率比二倍体高 排除杂种优势对后代选择的干扰

遗传研究中良好的实验材料体系；数量遗传、研究细胞分裂极分化 突变体筛选

Hamada（1999）用离子束处理烟草的花药，接种马铃薯病毒，从472株花药再生植株中获得15株抗病植株。

（6） 消除致死基因 （7） 选育新的自交系 （8） 遗传转化的受体材料

第三节 花粉培养

1、 优点：（1）花粉培养可得到单倍体

（2）可观察到单个体细胞开始雄核发育的全过程

（3）花粉能均匀地接触化学的物理的诱变因素，因而花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。 （4）能从每个花药得更多单倍体植株

2、花粉分离培养时期：花粉在单核时对于诱导雄核发育的外界刺激最敏感。 3、花粉分离的方法：

（1）自然散落法：将花蕾消毒后，取出花药，接种在培养基上，，当花药开裂时，花粉散落在培养基上。将花药去除。但效率低，一般不采用。

（2）机械挤压法

挤压花药：用平头大玻璃棒反复轻轻地挤压花药。

过滤收集：用200目的镍丝网过滤，使花粉进入滤液中心。

离心清洗：把滤液放入离心管中，在200r/min速度下离心数分钟，使花粉沉淀，吸取上清液，再加培养基悬浮，然后离心。反复3—4次。 把洗净的花粉沉淀：加入一定量的培养基。 （3）破裂释放法：用工具破裂花药。 4、花粉预处理

（1）低温处理：可以明显提高花粉胚的诱导率。例曼陀罗的花蕾连同花梗一起采下，将其插入水中，于3℃保存48h，促进花胚的产生。烟草的花药低温预处理在7—9℃下进行，处理时间7—14天为宜。

（2）离心处理：处理烟草单核后期的花粉再生频率从30.5%提高到38.2%。

（3）乙烯利处理：在减数分裂前用乙烯利喷施植株促使花粉细胞核分裂，促进愈伤组织形成。

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还有利用辐射、高温、变温、黑暗或生长素等处理，对于培养也有好处。 5、花粉培养 （1）平板培养法 （2）看护培养法

（3）条件培养法：合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。 6、花粉植株的倍性鉴定方法

（1）气孔保卫细胞长度：单倍体气孔保卫细胞长度60um以下，二倍体大于65um，标准率在90%以上。 （2）叶绿体数：染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数相关。 （3）细胞染色体数：采用根尖，镜检染色体直接计数。 7、染色体加倍

（1）自然加倍 离体培养过程中染色体自然加倍的现象得到二倍体纯合，可通过培养基成分、温度等条件调控。

（2）人工加倍 采用物理方法如加热冲击、伽玛射线冲击法

第四节 花药培养

一、 花药培养的一般程序

1、 材料的选取：以单核中、晚期花粉为宜，接种前用醋酸洋红、I-KI溶液等染色压片法，确定花粉发

育的时期，如果花药白色，则过嫩。 2、 处理的预处理：同花粉处理。

3、 材料表面灭菌：70%—75%酒精在表面浸一下在饱和的漂白粉溶液中，浸10—20分钟或0.1L消毒

7—10分钟，用无菌水冲洗。

4、 接种：每管接种30—60粒，接种密度高些好。

5、 培养：一般先在暗处培养，待愈伤组织形成后在移植光下培养，温度为25—28℃。 6、 花粉植株的移植：烟草每个花药上可产生200株以上的花粉植株。 二、花药培养方法

（1）琼脂固体培养基：在培养基加入0.5%-0.8%琼脂，浓度一般以花药有1/3浸入而不沉没于琼脂中为宜。

（2）液体培养法：在培养基中不加入琼脂，直接把花药接入呈液体状态的培养基中。液体培养基是一薄层（约0.5cm液层）

三、影响花粉培养成功的因素

1、材料的基因型 不同的植物，对花培的反应极为不同。一般茄科的植物花药培养容易成功，而棉花、大豆的花药培养至今尚未成功。

2、花粉的发育时期 接种花药的花粉发育时期，是决定花药培养能否成功的关键因素。如水稻、烟草的花粉，从单核中期到双核期皆可接受诱导，而小麦、玉米的花粉，以单核中期为佳，番茄、大麦则还要更早。

3、培养基的作用

（1）基本培养基：主要是MS、N6、B5、Miller、Nitsch等

（2）植物生长调节剂：在培养基中，起关键作用的主要是激素。生长素与分裂的比例决定愈伤组织的分化程度。

（3）糖对于花药培养的作用：主要是提高碳源和调节渗透压的作用。在烟草的花药培养中，蔗糖的浓度在1%—3%的范围内。当浓度达到3%时出苗率达到39.06%。当浓度达到4%时，出苗率降到17.72%。在花药培养中，蔗糖浓度一般以2%—5%为宜。在分化培养基中，蔗糖的浓度不宜太高，一般在3%左右，太高不利于苗的分化。特殊情况：大麦、小麦等需要9%左右。

（4）有机附加物：促进花粉发育也有着一定的作用。例如：水解乳蛋白（LH）、水解核酸（RH）、酵母提取物（YE）和谷氨酰胺等。

（5）活性炭的作用：促进花粉中愈伤组织和胚状体形成的作用。例如1%的活性炭，使烟草花药出苗率提高1—4倍。0.5%的活性炭，使玉米花药中愈伤组织或胚状体的诱导频率提高1倍左右。

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（6）培养基中PH值对培养效果的影响：当PH值达到5.8时，效果最好。PH值达到6.5时，花粉不形成胚状体，经镜检，未看到花粉发生细胞分裂。

（7）植株的生理状态：开花后期的花药不宜培养；缺N植株的花药易培养。

（8）条件培养基的作用：指植物组织培养可分泌某些物质进入培养基，使得培养基条件比，成为条件培养基。

思考：花药培养的意义；花粉的培养方法；花药培养方法。

第七章 原生质体培养及融合

第一节

一、原生质体的优点及意义

原生质体：把植物细胞除去细胞壁裸露的部分。 优点：（1）每个原生质体都含有该个体的全部的遗传信息，在适当的条件下，具有再生成与其亲本相似个体的细胞全能性。

（2）在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，可为细胞生物学、发育生物学、细胞生理、细胞遗传学及其他生物学科提供良好的实验体系。

（3）通过异源原生质体的融合，开展植物体细胞遗传远缘杂交不亲和机理等方面的研究，培育出具有优良经济性状的新品种。

（4）比完整细胞易于摄取外源物质。

总之在遗传转化、改良作物品种、生物学的基础研究有广泛的用途。

第二节 原生质体的分离及纯化

一、原生质体的分离

分为两步：先除去胞间层，游离出单个细胞，再除去各个细胞的细胞壁。 （1）机械法：将细胞放在高浓度的糖溶液中。

缺点：操作繁琐，产量低；只用于液泡分化程度较高的细胞或长形的细胞。很少使用。 （2）酶法：

所用浓度：纤维素酶浓度在0.5—3.0%，也较多的使用纤维素和果胶酶，柑橘用3%的果胶酶和纤维素酶获得较好的效果。分离原生质体所需的时间：短至30min,长至20h,一般在4—24h之间。

二、原生质体培养的材料来源

1、天然材料：包括田间栽培或野生的树种

（1）幼嫩叶片 是分离原生质体的号材料，取材方便，来源广泛。

（2）取材时间 一般在冬末春初时，可从幼树上切去40—50cm长带有休眠芽的枝条插在自来水中，并放置在生长室8—10天，就可以萌发出幼嫩叶片。

另外根、茎、子叶、下胚轴、果实等都可作为分离原生质体的来源。 选择合适的基因型、生理状态时培养成功的关键。

2、 人工培养材料

（1）无菌苗的子叶 无菌苗的子叶分离原生质体，不仅省略了表面灭菌的程序，而且获得较高产量的原生质体。

（2）愈伤组织或悬浮培养细胞 愈伤组织或悬浮培养细胞，是最广泛使用的原始材料。这些材料不受环境条件的影响，试验重复性好，分离的原生质体在产量上比幼叶或子叶的产量高。

缺点：需要多次继代后才适于用来分离原生质体。

取处于指数生长期悬浮培养细胞，不仅分离原生质体容易，而且可以获得大量有活性的原生质体。

选材注意的问题：1、选择具有形态分化潜力的材料，易于器官发生。

2、选择经过酶处理后可以达到大量原生质体的材料，使产量维持较高的水平。

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3、原生质体稳定性好，不易破碎。 4、原生质体活性高，可持续分裂。

三、细胞壁降解酶的种类和方法

降解细胞壁常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。

果胶酶是从根霉中提取的，用果胶酶可使细胞间的果胶降解，把细胞从组织中分离出来

纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其主要作用是降解细胞壁中纤维素，得到裸露的原生质体，此外，还常用的是半纤维素。

所需浓度：体积比通常1g鲜重，用10ml酶液。

注意：没混合液不能用高压灭菌，因酶被经高温会失活，必须采用微孔滤膜对酶混合液作过滤灭菌，常用的过滤膜孔径为0.45u。

PH值为4.7—6.0为宜。烟草分离原生质体需要两个PH值，一个是4.7，一个是5.7。 酶解温度最适25—30℃。

酶解时间：最短30min，长至20h。

四、 渗透压稳定剂

原因：细胞壁被酶解时原生质体内和原生质体外渗透势不平衡，会使原生质体胀破，最好用等渗溶液，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于细胞壁的分解。

常用的渗压稳定剂：糖溶液系统和盐溶液系统。 糖溶液系统：甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。 盐溶液：KCl(2.5%)、MgSO4.7H2O（1%）、KH2PO4或CaCl2等。 国内用的较多的是甘露醇、甘露醇与蔗糖的混合液。 盐溶液作渗透剂，优点：稳定原生质体、提高酶效等。 缺点：在培养时原生质体形成假壁。

最佳方法：先用盐作渗透剂，在培养原生质体时改用有糖溶液。

五、 原生质膜稳定剂

分离原生质体时，可以加入适量葡聚糖硫酸钾（0.2—0.3%）

氯化钙（0.1—10mmol/l） 磷酸氢二钾等化合物

上述对原生质膜起稳定作用，可增加完整原生质体的数目。 六、原生质体的分离

原生质体的分离步骤： （1）两步法

第一步：先洗净叶片，灭菌后，用镊子撕掉表皮，切成小块（约2g）浸泡于20ml0.5%果胶酶（附加葡聚糖硫酸钾0.3%、甘露醇0.7mol/l、氯化钾0.1—10mmol/l，溶液PH值为5.8）的溶液中，开始抽气减压3分钟，让酶液渗入组织以降解细胞间的果胶，将材料分离成单细胞，再通过离心收集细胞。

第二步：加入2%的纤维素酶，保温2—3h，酶液用甘露醇、氯化钙等配制（浓度同上），PH值为5.4，以降解细胞壁，释放原生质体。

如：白杨实生苗采用两步法，获得了高产量原生质体，每克鲜重组织得5.4x10 个原生质体。 （2）一步法 目前较为普遍适用的方法。

将果胶酶和纤维素酶混合使用（每克叶片加20ml酶液）结果仅一步既降解了中胶层，分解了由细胞壁而释放出原生质体。

对愈伤组织和悬浮培养细胞，根据情况稍加修改。

第三节 原生质体的纯化和活力测定

一、原生质体的纯化

沉降法 利用比重原理。

漂浮发 使用了比原生质体比重大、渗透压较高的溶液，使原生质体浮于溶液表面。 界面法 原理是两种比重不同的溶液，使健康和完整的原生质体处在两液相的界面之中。

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