芽增殖的2种途径：

器官发生的途径：不定芽：直接再生不定芽和愈伤组织不定芽（间接再生） 定芽：

一、带芽外植体的增殖（定芽）

外植体的来源：包括顶芽、腋芽、根茎连接处的萌壁。

1、 嫩梢扦插繁殖：芽生芽、枝生枝 一个月内增殖3~4代。关键是芽位的选择，以上部3-4节的茎段或顶芽较好。

2、 丛生芽增殖：茎尖、带腋芽的茎段或初代培养的芽，可使腋芽不断萌发，生长，形成丛芽，将丛生芽分离分割，再增殖为丛生芽。

3、 定芽快繁的优点：能保持遗传的稳定性，不易受培养条件的影响而发生变异。 4、 激素的浓度：

细胞分裂素：6-BA、PBA、KT、ZT、TDZ等 0.1~10mg/L、 生长素：NAA、IAA、IBA等。 5、 影响定芽增殖的因素

1） 与基本培养基配方有关；2）与激素配比有关；3）与外植体的生理发育年龄有关。

二、 不定芽：

1不定芽：除叶腋或茎尖以外，任何部位（非正常部位）产生出来的芽叫做不定芽。

形成不定芽的类型：不定芽的形成常随植株种类不同有极大差异。 直接再生：不定芽在外植体的表面直接产生；

间接再生：先诱导产生愈伤组织，然后愈伤组织上分化出不定芽。 2、不定芽的历程

1）外植体经脱分化过程；

2）由已脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞。 3、遗传的稳定性

不通过愈伤组织而直接形成不定芽的途径可保持原品种特性遗传稳定性强。而进过愈伤组织阶段，特别是多次继代的愈伤组织。

三、 体胚的发生

合子胚：精子与卵子结合形成合子，合子发育成胚，即由受精卵形成的胚。

体细胞胚（体胚）：不定胚或胚状体。

植物的体细胞胚发生：是指双倍体或单倍体的体细胞胚（非合子细胞）在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程，即利用各种体细胞组织，通过立体培养方式，诱导产生细胞配的过程和技术。

体细胞胚含义：1）体细胞是组织培养的产物；2）体细胞胚起源于非合子细胞（体细胞）；3）体细胞胚的形成经历胚胎发育过程。

胚发生过程：球形胚、心性胚、鱼雷形胚和子叶形胚直至成熟胚。 经体细胞胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体。

体胚发生的起源部位：1）由外植体表皮细胞直接产生胚状体；2）由外植体组织内部细胞产生胚状体。3）由愈伤组织的表面产生胚状体；4）由胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体；5）单个游离细胞产生胚状体。

体胚发生的主要形式：

（1）直接产生：是指体细胞胚不经过愈伤组织阶段而从外植体上发育而成。

（2）间接产生：对外植体中已分化，诱导处理主要是促进脱分化，进行发育命运的重决定，诱导出胚性细胞。

两者的区别：后者要经历一个愈伤组织阶段（单细胞或原生质体）培养的中间阶段。 影响胚状体发生的内外因子：

（1）基因型：杂种的外植体要诱导频率高；不同基因型：杂种的外植体要诱导频率高，一般都归因于基因型的影响，单倍体、二倍体、三倍体。

9

（2）外植体及生理状态：生理状态和发育程度、幼胚、下胚轴、子叶最佳。 34种针叶树体胚发生中由18种以未成熟胚，15种以成熟胚。 （3）培养基成分：

氮素：如以硝酸氮为唯一氮源的White培养基，则几乎不能诱导出胚状体； NH4/硝态氮：适当的比值为15：34 氨基酸：谷氨酰胺

K：K浓度增加，促进体胚发生。

铁盐：胡萝卜球形胚，缺铁不能发育到心形胚阶段； 其它无机盐：Mg、Zn

蔗糖：提高糖浓度增加，可增加体胚的发生。 激素：

（1）不加任何激素 柑橘、枸骨叶冬青；

（2）需加入2，4-D，对禾本科植物的体胚诱导特别重要； （3）只需加入细胞分裂素就可以诱导体胚发生；

（4）分裂素与生长素混合；脱落酸和赤霉素抑制胚状体的发育，但在培养的后期可添加。①可抑制不正常胚状体的形成，防止胚状体的畸形胚形成。②特别是在胚状体发育的后期使用脱落酸较有利。

（5）渗透压 影响植物体细胞胚胎发生的效果，通过增加糖浓度，提高渗透压；

（6）其它条件：加活性炭、光强、温度都会影响体胚的发生。蓝光新兴胚的发育。低温处理。 5、胚状体的形态特征

胚状体发育早期与发育的芽在外观上，1971年Haccius提出一个对胚状体鉴别较为合适的标准。 1）均具有两级性：有发育得早期，在方向相反的两端分化出茎端和根端；

2）胚状体的维管组织与母体植物或外植体的微管组织没有结构上的联系，所以通过震荡或镊子轻轻拨就可与其他组织分开。

3）与胚的发育不同，具有单极性的芽或根往往与母体植株或愈伤组织形成的维管束相连，因而不易分离。

6、人工种子：

由于胚状体具有两性的结构，可以直接形成再生植株，而其他再生途径必须经过多次续代，诱导生根，才能形成小植株，胚状体的再生途径比较节省人力物力。

分类：

第一类是裸露的或休眠的繁殖体。如适当干燥的体细胞胚。休眠的额微鳞茎和微块茎等，它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。

第二类是人工种皮包被的繁殖体。一些体细胞胚、原球茎等虽不能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持较好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。

第三类 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚，不定芽茎尖等，均需要先包埋，在液态凝胶中，再经过人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽率。

人工种子的制备：体细胞胚状体的诱导和发生时制备人工种子的基础。由种皮、胚、胚乳构成。体细胞胚胎外部包上人工胚乳、人工种皮就可以制备人工种子。

人工种子的应用：1）可大量繁殖转基因植株；2）快捷高效的繁殖方式，缩短育种时间；3）人为赋予种子多种优良品质；4）固定杂种优势，天然种子是有性繁殖。

优点：数量多、速度快、结构完整，再生率高等。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达??

第四节 植物离体快繁的常见问题

一、污染

污染的种类： 1.、细菌性污染 2、真菌性污染 3、内生细菌污染

10

1）概念：植物组织中普遍存在内生细菌；

植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌。

普遍性：金线莲：组培中的污染率达到50%；仙客来 块茎80%。

2）症状：表面细菌引起的污染通常在2-3天，就能在外植体周围或培养基表面，出现明显的或不明显的细菌菌落；

3）危害性：内生菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率低。 4、细菌污染及内生细菌污染的防治措施

对母树的预处理：1）改善植株的栽培环境；2）促发新枝；3）黄化处理；4）用抗生素进行预处理；5）改进灭菌方法；6）添加抗生素多次消毒，使用混合消毒液含PVP（聚乙烯）。

二、褐变

（一）产生原因：植物体内含有多酚氧化酶，当切割材料时，激活了组织中的多酚氧化酶，或破坏了组织中酶底物与酚类化合物被氧化，产生带棕褐色的醌类物质，这种醌类物质能毒害整个组织叫做褐变。 （二）影响褐变的因素：P80

1）基因型 木本植物比草本植物易引起褐变；2）外植体的生理状态；3）培养基；4）温度和光照；5）外植体大小；6）外植体组织的受伤程度；7）材料转移；8）用于外植体体表灭菌的化学药品。

（三）克服外植体产生河边的措施：1）选择适宜的外植体和培养条件（选旺盛生长的外植体）2）还原性物质或吸附剂（柠檬酸、硫代硫酸钠、活性炭）3）对培养材料进行预处理（基乙烯吡咯烷酮预处理（PVP），螯合剂螯合Cu2+）4）选择合适的培养条件：选择适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平以及pH值、低温按培养等可以防止褐变的发生。5）连续转移。

三、玻璃化苗：P182

（一）概念：试管玻璃化苗：即玻璃苗，就是试管苗的茎、叶变成透明水浸状，生长畸形，增殖系数明显

下降，难以诱导生根，即使诱导生根，其根系质量极差，移植成活率极低。

（二）玻璃化苗的特征：1）矮小肿状，呈半透明玻璃状；2）有时发育出大量短而粗的茎、扁平、节间很

短；3）叶片没有功能性气孔，由于保卫细胞的功能。

（三）产生原因：1）低温；2）水势和相对温度；3）培养时的过高温度；4）培养基中较低的琼脂以及铵

态氮，硝态氮的比例不协调。

（四）防治玻璃苗的具体措施：1）降低细胞分裂素激素水平，添加ABA，可减轻玻璃化现象；2）减少培

养瓶内的湿度，及培养基的含水量；3）纯化培养物；4）避免高温；5）提高培养基中琼脂含量，可达到1.1%；6）调整培养基供氮形势，减少铵态氮，提高硝态氮浓度；7）降低培养基温度；8）适当提高无机盐的含量，适当延长光照。

四、白化苗

在禾谷类作物培养中普遍存在的大量的白化苗，绿苗较少的现象。 26℃增加到35℃时白化苗增加。降温是有利于叶绿体的发育。

思考题：

1.灭菌与消毒的区别？Why？

2.常用的灭菌方法各有哪些优缺点？

3.采用高压蒸汽灭菌时，应注意哪些事项？ 4.根据发育方向，初代培养课分为几种？ 5.组配成苗途径有几条？

6.理解无菌操作的意义及途径？

7.污染、褐变和玻璃化产生的原因及预防对策？

11

第四章 植物微繁脱毒技术

一、病毒存在的危害

1、大多数不通过种子传播；

2、通过营养体进行传递，在母株内逐代积累。例：葡萄扇叶病毒使葡萄产量减少10-18%。 二、根除病毒的途径：

1、病毒病害与细菌和真菌病害不同，不能用药物处理； 2、消除营养体的病原菌； 3、用组培的办法消除。 三、病毒的分布特点：

1、感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异；

2、越靠近茎顶端区域的病毒感染深度越低，生长点（约0.1-1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少； 3、在老组织中较多；病毒数随着茎尖的距离的加大而增加。 4、在茎尖存在高水平的内源生长素，可以抑制病毒的感受； 分生

四、分生组织少毒的原因

1、在植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但分生组织中，不存在维管系统。 2.在旺盛的茎尖分生细胞中，代谢活动很高，病毒无法进行复制。 3.存在一种病毒纯化系统，分生组织不易受感染。 4.高水平的内源生长素，可以抑制细菌的感染。 五、热处理脱毒：

1、温汤浸渍处理：在50℃左右的温水中处理3-5min;

2、热空气处理：对活跃生长的茎尖效果较好。切取茎尖分生组织进行离体培养，生长室温度35-40℃。

三、茎尖培养脱毒

茎尖概念：茎尖培养按取材大小，可分为茎尖分生组织和普通组织培养两种类型。

茎尖培养无病毒的程序：热处理从受侵染的植株截取并单个茎段—剥去茎尖—茎尖培养—由茎尖培养出再生植株—病毒检验—症状（指示植物、电子显微镜、血清检验等）—获得无病毒植株—原种的保存（离体无性繁殖，在隔离区内大量繁殖）。

（一）茎尖分生组织：指茎顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm 分生组织能逃避病毒侵染的原因：

1） 在植物体内，病毒易于通过维管束而移动，但在分生组织中，不存在维管系统； 2） 在旺盛的茎尖分生细胞中，代谢活动很高，病毒无法进行复制； 3） 存在一种病毒纯化系统，分生组织不易受感染；

4） 在茎尖存在高水平的内源生长素，可以抑制病毒的感染。

（二）普通茎尖培养：指带有叶原基的较大茎尖，其大小从几毫米到几十毫米。

特点：操作方便，易成活，成苗时间短，所得的植株也可能是无病毒的。目前采用较大一点的生长锥（0.1-0.2mm，带1-2个叶原基）并结合热处理，得到很好的效果。

四、热处理结合茎尖培养

(一)

1）进行热处理 热空气：

(二)茎尖培养的操作：

1、 取材和消毒：茎尖生长期间，预先喷几次药，选用剪去2-3cm的壮芽，消毒过程同其他；

12