2）水解酪蛋白：100-500 mg/L 。

3）酵母提取物：0.01%-0.05%。YE：主要用于细菌培养。 4）麦芽提取物：0.01%-0.5%。 5）苹果和番茄的果汁等。

二、培养基的种类

基本培养基 完全培养基

按照培养基对植物的作用可分为：空白培养基（不加人激素的培养基）、诱导培养基（使植物细胞脱分化）、分化培养基（使脱分化的细胞再分化出根茎等器官）、生根培养基

常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM—8P培养基等 按培养基物理性状分：固体培养基和液体培养基（精致培养、振荡培养）

1）MS培养基：高盐培养基。1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特别是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较为合适。

2）B5培养基：低盐培养基。1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。

3）White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又做了改良，称White改良培养基，提高了MgSO4的浓度并增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。

4）N6培养基：1974年由中科院植物所朱至清等为水稻等禾谷类植物而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花药培养、细胞及原生质体培养。

5）KM-8P培养基：1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质的融合培养。

三、培养基的配制：

（一）母液的配制和保存

为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液。易于低温保存。一般为10~200倍。

MS培养基母液的配制：

母液1：为大量元素，包括 硝酸铵：33000mg、硝酸钾：38000mg、氯化钾-2H2O：8800mg、硫酸镁-7H2O：7400mg。配成20倍的母液，各化合物分别溶解后在顺次混合并加水至1000ml。

母液2：为微量元素，包括KI 166mg、硼酸 240mg、MnSO4-4H2O 4460mg、ZnSO4-7H2O 1720mg、钼酸钠-2H2O 50mg、CuSO4-5H2O 5mg、CoCl-6H2O 5mg。配成200倍的母液，化合物分别溶解后混合，加水至1000ml。

母液3：为铁盐，配成200倍母液，FeSO4-2H2O 5560mg、Na-EDTA-2H2O 7460mg。这两种化合物各用450ml蒸馏水溶解，然后混合并调节PH值为5.5，再加水至1000ml。

母液4：为维生素类，氨基酸母液包括肌醇20000mg，烟酸100mg、盐酸吡哆醇 100mg、盐酸硫胺素20mg、甘氨酸 400mg 形成200倍母液，各种化合物分别溶解再混合并加水至100ml。

注意事项：①配制好的母液分别贴上标签，注明母液号，日期及配制1L所得的能量；②放在冰箱内可保存几个月；③维生素和氨基酸类即母液4易发生霉菌，一次不易多配。④液体培养基的配制方法与固体相同。

（二）激素母液的配制

每种激素必须单独配制成母液，浓度单位mg/L（ppm），用时根据需要取用。因为激素用量少，一次可配成50ml或100ml。

各种激素配法：1）①将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95%的酒精中，再加水定容一定浓度。②NAA先溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容到一定浓度。③2，4—D可用少量1molNaOH,溶解后，再加水定容到一定溶度。④将KT和BA先溶于少量1mol的HCl中再加水定容。⑤将玉米素（ZT）先溶于少量95%酒精，再加热水到一定浓度。

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2）配制的激素浓度一般为200mg/L(ppm);

3）配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称，配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。 （三）工作培养基的配制

1、基本培养基配制：

1L MS培养基：母液1—50ml；母液2—5ml;母液3—5ml;母液4—5ml;

2、激素配制：一般生长素浓度的使用为0.05—5mg/L，细胞分裂素0.05—10mg/L；

3、母液一般配制100—200mg/L；培养基中添加的量：如要求NAA2.0，母液为200mg/L，配制1L培养基所取的量为100×2/200=10（ml）

4、定容至1000ml;

5、添加蔗糖溶液30g、琼脂6—7g;

6、调节PH值（较为关键）一般在5.8左右，因培养材料来源而异，大多数为5.6—6.0，用1N氢氧化钠和1N盐酸调整，高压灭菌后，PH值会向偏酸的侧移动0.1—0.3。

PH影响培养基的硬度 PH>6.5培养基会变硬，PH<5.0培养基不易凝固； 7、加热溶解； 8、分装； 9、灭菌。

配制培养基的注意点：1）在使用提前配制好的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，

如果瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；

2）用量筒或移液管取培养基母液之前，必须用所取的母液将量筒或移液管润洗2次； 3）量取的顺序写在纸上，量取一种，划掉一种，以免出错。

第四节 灭菌及无菌操作

植物组织培养成败的关键：保证无菌，避免污染。

一、 器皿和用具的洗涤（P28）：

玻璃器皿洗涤方法：先用碱洗，即用肥皂粉刷洗，用清水清洗，晾干。

难洗的器具：需用铬酸-硫酸混合洗涤液浸泡，浸泡后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。

二、 培养基灭菌及培养基、植物材料的消毒

（一）培养基的灭菌（高压灭菌）

一般程序：

1.按实验需求配制?? 2.??加水，防止干烧。

3.将培养基瓶，所用的培养皿，接种用的器具，蒸馏水等需要灭菌的东西放入锅内。 4.关上锅盖，拧紧。

5.打开电源，开始加热，至100℃，3~5min。

6.灭菌锅自动关上排气阀，开始加压，温度继续上升，温度到达121℃。 7.维持此温度，压力维持0.1~0.2MPa下，保持10-20分钟。 8.时间到后自动降压降温至100℃，压力为零。

9.在94℃时切断电源，可打开锅盖，取出培养基冷却，灭菌完毕。 灭菌最少时间： mL 20~50 75~150 250~500 1000 min 15 20 25 30 注意事项：①在灭菌之前一定要检查锅中的水位，严禁干烧，以免造成事故。

②灭菌前还需检查排气阀是否关上。

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③只有当锅中压力为零时才能打开锅盖，否则会有危险。 ④锅内应留有空隙，不能太满。

⑤灭菌时间不宜过长，也不可以超过灭菌锅规定的压力范围。

（二）物体表面灭菌

灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌。

范围：桌面、墙面、双手、材料表面。

消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭，洗衣粉；吐温-80。 （三）接种工具灭菌

用前干热灭菌 160-180℃，1.5-2.0h 用前湿热灭菌 121℃，20-30min

接种前用酒精棉球檫试，侵入95%酒精液中，并在酒精灯上灭菌。 （四）实验服、口罩、滤纸灭菌

湿热灭菌 121℃，20-30min ??

（五）接种室灭菌

紫外灯照射（接种室、超净台、接种箱）：波长260nm，距离小于1.2m，2.-30min。 臭氧灭菌机：1~2h。

熏蒸灭菌：5-8mL/m3甲醛+5g/m3高锰酸钾；冰醋酸。 接种台喷雾消毒：75%酒精。 （六）培养室灭菌

新建培养??

隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地一次，用高锰酸钾擦。

三、无菌操作

灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面积和孔隙内一切微生物或生物体，即所有有生命的物质全部杀死。

消毒：杀死、

消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。 常用化学消毒剂：

灭菌剂名称 使用浓度% 清洗难易 灭菌时间 灭菌效果

70-75 0.1-3 酒精 易 好

Ca(ClO)2 9—10 易 5—30 好

0.1-0.2 2-10 氯化汞 较难 最好

酒精灭菌的原理：

1) 酒精具有较强的穿透能力和杀菌力，它使细菌蛋白质变性。使用的浓度一般为70—75%。

2) 处理时间15—30s，不宜太久，因此细胞容易收缩脱水。它具有浸润和灭菌双重作用，适用于表面消毒；

3) 在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，可提高杀菌效果。

植物材料消毒程序：1）清洗（流动自来水冲洗数小时，洗衣粉毛刷等清洗）；2）灭菌剂浸泡灭菌；3）无

菌水清洗4、5次擦干；4）加表面活性剂（吐温-20或吐温-80，加强表面活性剂，磁力搅拌，超声振荡）。

常规二次消毒法：材料先放入70%的乙醇中，约30s后再在0.1%的氯化银中浸泡，2—0min，或在2%次氯

酸钠中浸泡20min,然后用无菌水冲洗3、4次。

四、广谱实验法

在广谱试验中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机物质、生长素、细胞分裂素 4类物质各3种浓度的自由组合即构成了3项包括81个处理的实验。

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第五节 培养条件

1.光照：组织培养中有的材料需要在按条件下培养，有的需要在光条件下。 2.温度：

低温：使培养物生长停顿。 高温：不利于培养物生长，?? 变温：??

3.湿度：70%~80%

思考题：

1.一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？ 2.组织培养常用的设备有那些？各有何用途？ 3.组织培养的条件有那些？

第三章

第一节 植物外植体选择及其消毒

1、外植体的特点：

植物生长都要经过幼年期和成年期两个大的阶段。幼年期是植物早期生长阶段。成熟过程发生在幼态组织中。植物组织一旦进行细胞“决定”，并就如成熟态，则一般不可以逆转，而且具有很强的稳定性。这种稳定性可以通过许多代细胞分裂而传递，类似一种“记忆”功能。

成熟度分布：对于同株植物从幼年到成年转变是由茎基部向顶部转变的，即木本植物基部通常是幼年期，顶部是成熟期，中部则是中间类型。

植物的微体快繁，一般称为微繁殖，分为四个阶段：1）选择、2）增殖、3）壮苗和生根、4）试管苗的移植

复壮：P54

完全复壮：由成熟组织或细胞经胚胎发生形成正常的幼态植株。有性生殖产生的合子是自然的完全复壮。

部分复壮：树木器官、组织细胞中仅仅有某些成熟特性消失和某些幼态特性重现，发生变化的特征和发生变化的过程可能各不相同，但组织或细胞在一定程度上恢复了形态发生能力。

复壮措施：1）栽培技术措施：将成熟枝条的接穗嫁接到幼嫩砧木上。反复修剪和强修剪以矮化母株可能提高复壮程度。2）物理化学措施：NaOH、H2SO4、萜烯、抗菌素等化学处理。3)组织培养措施：幼年部位的外植体要比成年部位外植体容易组织培养成功。对于取自成熟植株的外植体组织培养时可采取以下方法：外植体小型化、离体培养物的连续培养、组织培养中使用的培养基添加剂（激素等）。

2、外植体的种类：1）带芽外植体：顶芽、腋芽、根茎连接处的萌蘖等。2）胚：指天然状态和试管中精卵融合受精后形成的各个时期的胚。

3、外植体选择的特点：①选用实生苗组织②植物的种质：成年优树作为供体母树（如抗逆性、产量高、品质好等）③各器官的生理、发育年龄、幼态区的分布（分布部位）④外植体的增殖能力⑤注意取材时的季节和时间。春季较好，秋季较差，雨季不易成功⑥选取材料的大小：茎段0.5-1cm，脱毒苗外植体0.2-0.5cm。

4、外植体的消毒：

植物材料的预处理：1）修剪树木组织。2）先培养在无糖的培养基中。3）避免在雨天取样。

5、茎、叶的消毒：①用流水冲洗②洗后先用70%乙醇浸20-30秒钟③再置于第二种消毒药剂浸泡消毒④无菌水洗4~5次。

6、果实种子的消毒（基本同上）

7花药的消毒：将幼穗或花蕾进行体表灭菌即可。

第二节 外植体的增殖

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