第一章 绪论

植物繁殖方式：分株、播种、压条、扦插、嫁接、组培繁殖

一、组培的概念：

狭义：在无菌条件下，将离体的植物组织小块，在适宜的人工培养和环境条件下进行无菌培养，使培养体逐步分化出器官，一个组织或单个细胞（甚至用原生质）接种到培养基，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等人进行培养，使其形成完整植株的过年。）

广义：通过无菌操作，把植物体的一个器官、一种组织或单个细胞（甚至原生质）接种到培养基，在人工控制的条件下（营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其成为完整植株的过程。

狭义与广义：组织范围不同。

二、组培发展史

诞生

1、植物组织培养技术的诞生可以追溯到19世纪末20世纪初。 2、1839—1840年，施莱登和施旺创立了“细胞学说”。

3、1902年，德国 生理学家 Haberlandt 提出了高等植物细胞全能性理论。

4、1934年，美国 White 利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，离体根的培养获得成功。 5、1943年White 发表了《植物组织培养手册》 6、1962年 Marshing和Shong发明了MS培养基。

Gautherer White Nobecount 一起被誉为组织培养学科的奠基人。 组培发展

1、1948年 Skoog和崔徵通过对烟草茎切断和髓培养组织研究确定了腺嘌呤，生长素是控制芽和根的生长。

2、1956年 Miller等发明了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素。 3、50年代至今，组培迅速发展

1971年， Takebe在烟草上首次使用原生质体获得自身植株。 1962年，印度Guha 毛叶曼陀罗 花药培养 1973年，Carlson 两个烟草物种原生质体融合

1983年，Zambryski 用根癌农杆菌转化烟草 转基因植物 1978年， Murashige 提出“人工种子”的概念。

三、组培术语

1、外植体（explant）:从植物体分离下来用于离体培养的材料；

2、愈伤组织（callus）:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，躲在植物体切面产生。

3、分化（differentiation）:细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。

4、脱分化(differentiation)：原已分化的细胞，失去原有的形态功能，又恢复到没有分化的雾组织的细胞团和愈伤组织，（即转变为分生状态）这个过程称为脱分化。

5、再分化（redifferentiation）:在一定的培养条件下，经过脱分化的组织和细胞，经重新分化而产生新的组织和器官（如由愈伤组织形成芽、根或胚状体），称为再分化。

6、胚状体（embroid）：在组织培养中，从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。

7、初代培养(first culture)：外植体的第一次培养。

8、继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料。

9、植物细胞全能性（totipotent）:植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育为完整

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植株的潜能。因为每个细胞都是来自于受精卵，所以有与受精卵具有相同的遗传物质。

10、生根培养：

11、驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。 组培的一般过程：

初代培养—继代培养—生根培养—驯化培养

四、组培的分类

1、按培养基分类

培养体：固体 液体（静止、旋转、纸桥、震荡） 2、根据外植体分类：植株培养

器官培养：根系培养、茎段培养、叶片培养、花器培养、果实培养、种子培养 组织培养：分生组织培养、薄壁组织培养、疏导组织培养 胚胎培养：看护培养、平板培养、悬浮培养、微室培养 原生质体培养：非融合培养、融合培养

五、组培的特点：

1、培养条件可以人为加以控制； 2、繁殖系数大，培养周期短；

3、管理方便，有利于实现工厂化生产和自动化控制。

六、组培的应用

（一）快繁 突出优点“快”

应用：工厂化育苗（industrializing propagation）：兰花、桉树、非洲紫罗兰、大花蕙兰 体胚发生：枸杞、核桃、苹果、青扦 （二）植物脱病毒（virus free）：马铃薯、甘薯、草莓、苹果、香石竹等。通过托病毒可以保持园艺植物的

优良性状。

（三）种质保存：加入冷冻保护剂，有利于细胞，胚状体，试管苗，愈伤组织等的长期保存。 （四）植物育种：

1.单倍体育种：通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株。 2.胚培养，子房培养，胚珠培养 3.突变体的选择和应用 4.体细胞杂交和遗传工程 5.遗传转化与基因工程

（五）有用化合物的工程化生产

生产化合物：强心苷、吲哚生物碱、喜树碱、银杏黄酮和内酯

七、组培的生理依据

1、植物细胞的全能性

2、激素在分化过程中的作用

在分化过程中植物激素的作用是明显的，合适的激素配比在器官分化有重要作用。

第二章 实验室的设备和操作

一、实验室的设计

洗涤室—准备室— 无菌操作室—培养室—观察室

（一） 洗涤室（cleaning room）大型水槽，最好是白瓷水槽、铺垫橡胶、上下水道要畅通、塑料筐 （二） 准备室 洗涤室+配置室=准备室（化学实验室）

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1.设备及器具：

1） 大型工作台：用于配置培养基母液和培养基等，其高度应方便配制工作； 2） 药品柜：用于放置常用药品。 3） 普通冰箱

4） 电子分析天平和托盘天平 用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品准确为0.0001g。 5） 电蒸馏器

6） 电炉或微波炉：用于琼脂的溶解 7） 酸度计

8） 培养基分装设备 9） 高压灭菌锅：必备的

10） 恒温培养箱：生化培养箱、光照培养箱、人工气候室、植物生长箱

11） 烘箱：用于干燥需要保持80—100℃；干热灭菌需要保持150℃，达1—3h。 2.灭菌室

（三）接种室（无菌操作室tranafering room）

宜小不宜大，一般8平方米，吊装1—2盏紫外线灭菌灯。 超净台（cleaning table）：有水平式，垂直式、单人操作和双人操作。 解剖镜：通常放大5—80倍；带有照相装置。

无菌操作的器具：酒精灯、镊子、解剖刀、解剖刀片、医用剪、广口瓶 （四）培养室（culturing room）:

作用：用于培养接种的植物材料，培养室要求具有一定的照明及控温、控湿设备（全自动）。 具有以下条件

1、温度：15℃或23—28℃左右，安装空调设备； 2、湿度：70%—80%之间，可安装加湿器； 3、光照：1500—3000lx;

4、时间：10—16h，控制日照时间，可安装定时开关；注意长日照植物与短日照植物对光的需求。5、培养架 6、摇床及转床

二、玻璃器皿及用具：试管、三角瓶、培养皿等。

（一）对玻璃器皿的要求：1、耐腐蚀，耐高温，高压；2、透明 3、易于放外植体（口径大） （二）规格要求：1、长试管：2.0x15cm;2.5x15;3.0x15。

2、三角瓶：一般用于液体培养，50—250ml口径在2.5—3.0cm 3、培养皿：用于固体培养基，特别用于转基因植物叶片培养 4、T型试管和L型试管 5、培养瓶

6、封口瓶塞：要求 具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染 7、选瓶机 （三）其它工具

细菌过滤器：用于一些被高温破坏，不能进行高压灭菌的物质，如：吲哚乙酸、玉米素等 孔径在45um左右

细胞计数器：血板计数板 烧杯、量筒、移液管、移液器 （四）接种工具

消毒器具、长短镊子（25cm）、解剖刀、剪刀、接种针、酒精灯、接种铲、过滤网

第二节 培养基

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一、培养基的成分

培养基（culture medium）是植物组织培养的重要基质。只有筛选出合适的培养基，培养才有可能成功。 培养基的成分主要有：水、无机盐、有机化合物、生长调节物、天然附加物、支持物 （一） 水分：蒸馏水或重蒸水

（二） 无机盐：是植物生长所必须的化学元素，主要包括大量元素和微量元素。

大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等

微量元素：小于10-5-10-7mol，碘、铁、硼、锌、铜、锰、钴、钠 配制铁时需要用Fe2（SO4）3和FeCl3在pH5.2以上 （三） 有机化合物（organic compound）：有机营养包括糖、维生素、肌醇及氨基酸 （1）糖类：植物组培时，光合作用很弱，需在培养基添加糖类。

作用：1）作为生长发育所需的碳源和能量；2）维持一定的渗透压（1.5-4.1大气压之间）。

最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组培中也有应用。

糖浓度：1）蔗糖使用浓度在2%—3%，常用3%，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%。 （2）维生素：常使用浓度1—1.0mg/l之间，以B族维生素为主。如：维生素B1、B6、B9、VB5、VH、VM、

VC（抗坏血酸）等。 （3）肌醇（环己六醇）：用量一般为50—100mg/l。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽

的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁形成有作用。 （4）氨基酸：是蛋白质的组成成分。

常用的氨基酸有甘氨酸。其它精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、丙氨酸等也常用，另外多种谷氨酸混合 如水解络氨酸（可促进胚胎发生）。 （四）生长调节物：生长素 细胞分裂素

1）生长素类：在组培中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂，伸长生长。

吲哚乙酸（IAA）：可人工合成，其活力较低，高温高压易分解。 萘乙酸（NAA）：在组培中的启动能力要比IAA高出一倍，可以人工合成耐高温高压，不易被分解破坏。

NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA吲哚丁酸：促进发根能力较强的生长物质。

2，4—D：促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。 GA：用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。 2）细胞分裂素(cytokinin)：腺嘌呤的衍生物，6—BA、KT（激动素）、ZT（玉米素）、TDZ

ZT的活性最强，单非常贵，常用G-BA。 作用：（1）诱导芽的分化，促进侧芽的萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用； （2）促进细胞分裂与扩大； （3）抑制根的分化。

多用于诱导不定芽的分化??浓度甚微，0.05~5mg/L。 （五）培养材料的支持物

（1）琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在6—10g之间（0.6—1.0%）；影响琼脂的凝固能力的因素：与原料、厂家的加工方式有关；与高压灭菌时的温度、时间、PH值等因素有关。长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱使琼脂发生水解，时间过久，琼脂变褐，会逐渐丧失凝固能力。PH在5.8左右。

优点：操作简便，通气问题易解决，便于经常观察研究等。

缺点：培养物接触面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用；同时培养物排出的代谢物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。

（2）其他支持物：玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出有害物质。

（六）附加物：天然复合物，其成分比较复杂，大多含氨基酸，激素，酶等一些复杂化合物。

1）椰乳：使用最多，效果最大。10%~20%。

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