生命科学学院 病毒生物学 λ 噬 菌 体 综 述 摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。本文就λ噬菌体的基因组结构、溶源化状态的建立 和基因工程应用做简要的综述，分析存在的问题，并对研究方向进行了展望。 病毒生物学

关键词：λ噬菌体 溶原性 溶菌性 基因克隆 引言：

大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。

λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。感染时吸附位点为细胞壁。属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 1、The discovery of bacteriophage lambda

1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一个证明了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K-12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。从此之后，λ噬菌体被广泛用于模式物种；

1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了λDNA整合到细菌DN A的机制；之后由λ噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。 2、The characteristics of bacteriophage lambda 2.1、结构特点：

λ为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径

约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp），因分子两端各有一含12个核苷酸的黏性末端，故又可黏合成环状分子。有柔韧的管状长尾，无收缩尾鞘，长约150nm，末端有一根尾丝，蝌蚪状。

病毒毒粒的基本结构是包围着病毒核酸的蛋白质外壳，即壳体（capsid）或称衣壳。壳体是由大量同一的壳体蛋白单体分子，即蛋白质亚基（protein subunit）以次级键结合形成的。基于物理学原因和相对简单的几何学原理，由蛋白质亚基构成的病毒壳体主要取螺旋对称和二十面体对称两种结构形式。如图1，λ噬菌体头部为二十面体对称结构，而柄部为螺旋对称结构。

由λ噬菌体结构可以看出，其属于复合对称结构，即具有二十面体对称的头部和螺旋对称的柄部。

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图1: λ噬菌体的结构 图2 λ噬菌体电镜照片

2.2、基因组特征：

λ噬菌体的基因组，为两端不闭合的线型双链DNA，约占粒子重的54%，分子量为30.8×106道尔顿，48502核苷酸对，长度为17μm，λDNA分子两末端的5’端称为成熟末端，粘性末端由噬菌体颗粒提取的DNA，其线性分子与两端连接呈环状的分子，可成一平衡状态，但环状分子两条链各有一缺口。在DNA分子浓聚的情况，分子末端之间连接，可以发生聚集现象。由于DNA两条链的碱基差异，得到的分开的两条单链，分别称为l和r链（左和右链）。l链的走向是从5’→3’的方向，所以是左向或反时针方向转录，5’末端称为m末端，末端碱基为鸟嘌呤（G）。r链的5’→3’走向与l链相反为右向或顺时针方向转录，链的5’末端称为m’末端，其末端碱基为腺嘌呤（A）。感染进入菌细胞的λDNA两互补端联结，成为环状DNA分子，并由宿主细胞的连接酶将两端的缺口封闭成环状DNA分子，噬菌体进行复制、转录和整合。如在离体的条件下，用DNA聚合酶将此单链的黏性末端补平成双链，DNA就失去其生物活性，不再能有复制和溶原化的能力。

图3: λ噬菌体的DNA线状图谱

λ基因组可分为四大簇，它们分别是调节区、重组区、复制区和结构基因区(包括与头、尾部合成及组装、裂解有关的基因) .整个基因组如图所示，可分为三个部分，①左臂：长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始

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均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。

根据λDNA的环状结构，可将66个可编码的基因分成3个功能区（function block）： 右边的功能区参与衣壳形成和DNA的复制，称为右操纵子区； 左边的功能区与裂解生长和溶源化功能有关，称为左操纵子区；中央功能区是λ基因组调控操纵子区，也称为免疫操纵子区。

图4：λ基因组环状图谱及主要的基因

λ噬菌体基因组的最大特点是在双链线状DNA两端各有12bp的粘性末端，可以环化，该粘性末端形成的双链区域称为cos位点（cohensive-end site）。如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。

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图5:通过cos位点，可形成双链环状复制型DNA（RF DNA）

2.3、λ噬菌体的侵染过程 （1）吸附

吸附是病毒表面蛋白与细胞受体特异性的结合，导致病毒附着于细胞表面，这是启动病毒感染的第一阶段。 病毒吸附蛋白

病毒吸附蛋白（viral attachment protein, VAP）是病毒毒粒表面能够特异性地识别细胞受体并与之结合的结构蛋白分子，亦称作反受体（antireceptor）。无包膜毒粒的反受体往往是壳体的组成部分，有包膜病毒的反受体为包膜糖蛋白。编码反受体的基因的突变、能够灭活或破坏反受体的蛋白水解酶、β-糖苷酶及中和抗体等均可导致反受体与受体相互作用能力的丧失，进而影响病毒的感染性。 细胞受体

病毒的细胞受体亦称病毒受体，是指能被病毒吸附蛋白特异性地识别并与之结合，介导病毒进入细胞，启动感染发生的一组细胞膜表面分子，其大多数为蛋白质，亦可能是糖蛋白或磷脂。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。 病毒的吸附过程

病毒毒粒与宿主细胞的初始结合往往涉及一个VAP分子于一个受体蛋白分子的结合，这种结合并不紧密，是一可逆过程。当毒粒上的多个位点与多个受体结合时就可能发生不可逆的结合，即发生吸附增强作用，这种增强作用使得毒粒与细胞的结合更加稳定、牢固。病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性作用及范德华力。 （2）侵入

侵入又称病毒的内化，这是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。λ噬菌体采取注射的方式将噬菌体核酸注入宿主细胞。

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（3）脱壳

脱壳是病毒侵入后，λ噬菌体的壳体除去而释放出病毒基因组的过程，它是病毒基因组进行复制和功能表达所必需的感染事件。λ噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，仅有病毒核酸及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。 （4）病毒大分子的合成

λ噬菌体多数情况下进行溶源型感染，因此原噬菌体整合至宿主细胞染色体上，随其进行复制和转录。在这一过程中多发生的各种病毒复制事件存在着强烈的时序性。病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间组织，即病毒基因组的转录是分期进行的。根据病毒大分子合成过程中所发生事件的时间顺序，可以将此过程划分为3个连续的阶段：病毒早期基因的表达；病毒基因组的复制；病毒晚期基因的表达。

λ噬菌体DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化，或形成由数个单位长度DNA以相同方向连接形成的DNA复制分子，即多连体（concatemers），以保护λ噬菌体DNA免遭宿主细胞核酸酶降解。整合有原噬菌体的宿主细胞不能够再次接受同源噬菌体的感染。 （5）装配与释放

特定情况下，整合于宿主细胞染色体上的原噬菌体会从上面分离下来，表达出λ噬菌体必需的结构蛋白以及多种物质后，装配成为完整的λ噬菌体病毒毒粒，进入溶菌阶段，将宿主细胞裂解开而释放出来，再次侵染其他正常的宿主细胞。

3、Lysogenic and lytic process of λ-phage

当 DNA侵入宿主细胞后。溶原和裂解途径的最初过程是相同的。两者均要求前早期和晚早期基因的表达。然后发生歧化．前早期和晚早期基因表达最终产生cI蛋白，使 进入溶原状态，而晚期基因表达使λ进入裂解循环。两个途径不是截然分开的．溶原化循环包括3个阶段：溶原的建立、保持和噬菌体的释放．第一个阶段是 DNA整合到宿主染色体上。成为前噬菌体状态．第二个阶段是阻遏白操纵子的表达。其产物cI蛋白与cI基因左、右两边操纵子(即早左操纵子和早右操纵子)的操纵基因(OL和OR)结合，抑制它们的转录。阻断整个溶菌途径。溶原状态得以保持．但在紫外线等因素作用下，CI蛋白被钝化，前噬菌体又被切割下来，进入裂解途径的基因调控程序．

图6: λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式

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溶菌途径的建立过程按时间顺序可划分为3个阶段，前早期，晚早期和晚期．这三个阶段实质是由三个操纵子，即早左、早右操纵子和晚期操纵子的相继激活，合成了三种重要的调节蛋白，即N蛋白、Cro蛋白和Q蛋白．当溶原化细菌进入溶菌状态时，c I基因即行关闭，CI蛋白不再合成，解除了CI蛋白对早左、早右两个操纵子的控制，这就是前早期基因的表达．前早期基因表达产物为N蛋白和Cro蛋白．Cro蛋白阻遏CI蛋白的合成，从而使 得以进入裂解循环，而N蛋白使前早期基因的转录越过终止信号而进入晚早期基因，为溶原和裂解的歧化做好准备．

图7：噬菌体的调节基因和转录次序图

晚早期主要是使早左与早右操纵子表达完全，包括早左操纵子的整合基因、割离基因和重组基因的表达，以及早右操纵子的调节蛋白基因Q、Cro、cII、cm和复制基因0、P的表达，这些基因的完全表达即为溶原和溶菌的歧化做好了准备．

λ噬菌体对两个生活史周期的选择取决于CI蛋白和Cro蛋白两者相拮抗的结果．前早期和晚早期基因的表达使Cro蛋白和CI蛋白均积累起来，CI蛋白抑制除自身外的一切基因的转录．如果CI蛋白占优势，它就阻止λ的复制，促进整合作用的发生，使溶原状态得以建立和维持．Cro蛋白则抑制c I基因的转录，因此是一种抗阻遏物．如果Cro蛋白占优势，CI蛋白不能合成，噬菌体即进入营养繁殖周期．晚早期的Q基因产物是晚期基因表达的激活蛋白，Q蛋白积累到一定程度，基因表达便进入晚期阶段，这个阶段已不再需要早期基因表达，这时由于Cro蛋白的积累而将之关闭．

晚期表达的基因主要是晚期操纵子基因．这个操纵子上有20个结构基因，它们占λDNA基因的一半左右．因此，晚期操纵子作为一个独立的操纵子十分重要，这些基因的独立开启和调节，更有利于这些蛋白的合成，使整个溶菌过程得以完全实现．

因此，λ的溶原和溶菌途径是在λ 的四个操纵子控制下依次完成的．在这四个操纵子中，阻遏蛋白操纵子是一个起总控制作用的操纵子，是λ基因组的总开关，它决定λ噬菌体潜伏或裂解的命运．有人把λ的四个操纵子的这种活像接力赛似的，单线联系的调控程序又比喻为瀑布式调控，既形象又客观。每一个操纵子就像一

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个台阶，λ的遗传信息流就是这样一泻到底，蛋白质合成了，成熟的噬菌体装配好了，裂解途径也就结束了．因而，λ基因调控的线性规则，既简单又科学． 4、λ噬菌体在生物学中的应用 4.1、λDNA作为外源基因的克隆载体

λ基因组中间部分占30% 的DNA(包括重组和溶源化基因)并不是噬菌体裂解生长所必需的，裂解生长所需的基因都在基因组的左侧和右侧，而典型的λ克隆载体在部分或全部非必需基因的两侧含有限制酶位点，这就赋予了λ载体克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位点之间，在体外包装成噬菌体，虽然包装效率仅达10%，但一经包装，在大肠杆菌中形成噬菌斑的效率可达100% 。目前由λ衍生的许多载体被广泛地应用于基因克隆中，尤其是在构建基因文库中的应用产生了非常好的效果。 4.2、λ类噬菌体载体构建

构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。

按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 另一种是替换型载体（replacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。

在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。 （i）插入型载体

外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galactosidase）两种亚型。

①免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。

②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着β半乳糖着酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。 （ii）替换型载体

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替换型载体又叫做取代型载体（substitutionvector），是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。

λNM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种λNM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。 用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：

第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。 第二，将上述所得的人DNA臂同外源DNA片段连接。

第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。

图8：cosmid克隆的一般过程

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5、小结

噬菌体对分子生物学的发展起到了重要的作用。很多噬菌体是目前了解最清楚的，研究最深入的有机体。自从1974年第一次证明λ噬菌体作为克隆载体的可能性以来，λ载体已在分子克隆中扮演重要角色，现在已有各种用途的复杂载体可供选用，它的发展是由于对这个噬菌体的生理和遗传已进行三十多年的研究，积累了丰富的资料，使人们对噬菌体的结构和功能较为清楚，同时对大肠杆菌的研究亦已清楚，这些知识的积累使λ噬菌体迅速发展成为克隆载体。

此外，λ噬菌体已在其他许多领域的研究发挥重要的作用，如对局限性转导 ，半乳糖血症，假单胞菌和抗生素耐药性的研究具有重大意义。λ噬菌体由于结构比较简单，遗传信息了解比较透彻，故在很多地方仍有很好的研究价值。因此我们以后对λ噬菌体的研究可以从多方面多角度进行。 6、 参考文献

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