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（5）发酵过程中发酵液随菌的代谢活动不断变化，也是泡沫消长的重要因素 4、发酵中控制泡沫途径有哪些？

答：① 调整培养基的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）、或改变某些物理化学参数（如pH、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。但效果有限。 ② 选育在生长期不产生泡沫的微生物突变株。如有人已用杂交育种方法选育出不产生泡沫的土霉素菌株。

③ 机械消泡

④ 化学消泡：加消泡剂，当今发酵工业中常用的方法。 5、常用消泡剂有哪几类，并简述其性能？

答：常用的消泡剂有以下几类

（1）天然油脂。天然油脂是最早用的消泡剂，它来源容易，价格低，使用简单，一般来说没有明显副作用，如豆油、菜油、鱼油等，除了用作消泡外，还可作为碳源和中间补料用。油脂主要成分是高级脂肪酸酯和高级一元醇酯，还有高级醇、高级烃等。但油脂如保藏不好，易变质，使酸值增高，对发酵有毒性。此外，有些油是发酵产物的前体，如豆油是红霉素的前体，鱼油是螺旋霉素的前体。近年来出于对环境保护的重视，天然产物消泡剂的地位又有些提高，而且还在研究新的天然消泡剂 。

（2）聚醚类消泡剂。聚醚类消泡剂种类很多，常用的主要是：聚氧丙烯甘油（GP型消泡剂） ，用于链霉素发酵，代替天然油，加入基础料，效果很好；聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型消泡剂）。它们以一定比例配制的消泡剂叫泡敌，用量为0.03%～0.035%，用于四环素发酵效果很好，相当于豆油的10~20倍。

（3）高碳醇。高碳醇是强疏水弱亲水的线型分子，在水体系里是有效的消泡剂。C7~C9的醇是最有效的消泡剂。

（4）硅酮类。最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高。纯粹的聚二甲基硅氧烷，不经分散处理难以作为消泡剂。可能是由于它与水有高的界面张力，铺展系数低，不易分散在发泡介质上。因此将硅油混入分散剂SiO2气溶胶中，构成复合物，经一定温度、一定时间处理，就可制得。 6、对于粘稠发酵液应选怎样的消泡剂，对于较稀的呢？

GP型消泡剂亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以宜使用在稀薄的发酵液中。它的抑泡能力比消

泡能力优越，适宜在基础培养基中加入，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。

GPE型消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，但溶解度也较大，消泡活性维持时间

短，因此用在粘稠发酵液中效果较好。

第五章 发酵过程控制（五）

1、中间补料的意义和原则是什么？补料方式有哪些？

意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期推迟菌体自溶。另外加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。 原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。 补料方式：

2、查阅文献，说明补糖时间和补糖量的控制。

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补糖量的控制，以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。

一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还原糖水平维持在0.8～1.5%之间较为合适。 例：不同补糖速率对L-缬氨酸发酵的影响

初糖浓度为80g/L，发酵30h后，分别以10g/L·h、 25g/L·h、 40g/L·h的补糖速度进行，结果如下：谷氨酸棒杆菌 补糖速度(g/L·h) L-缬氨酸（g/L） 菌体浓度（g/L） 对葡萄糖的转化率（%） 10 25 40

50.42 52.23 49.33 16.3 17.1 16.8 33.61 34.82 32.89 补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上

菌体已老化，合成产物的能力本身都很低了。 例：四环素

补糖时间 96h效价

20h 6000u/ml 45h 10000u/ml 62h 6000u/ml

说明：开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决定，即根据基础培养基的碳源种类及用量、菌丝生长情况、糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为依据。 3、前体对发酵有哪些影响？通过例子说明前体该如何使用。

添加前体:显著增加产量、控制发酵方向。 苯乙酸对青霉素产量和类型的影响

苯乙酸添加速 度% 0 0.025 0.050

苯乙酸浓度过高时对青霉素有毒性。但在pH低时比pH高时对青霉素毒性大，因此发酵早期pH 低时加入会影响青霉素产量。

含高浓度苯乙酸(0.5%)的培养液pH酸性时毒性很大，但在低浓度(0.3%)培养液pH酸性时并不显毒性作用。

由于高浓度有毒性，苯乙酸应多次少量加入或采取流加方式。另外，前体添加时间也需要考虑，要通过实验来确定。

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苯乙酸总量% 0 0.18 0.40 青霉素产量 550 1321 1823 青霉素类型 X 13.6 2.1 0.2 G 31.8 82.8 96.2 F 22.8 7.3 1.9 FH 17.6 5.1 1.2 博学慎思，明辨笃行

4、查阅文献，了解补料方式对发酵的影响。

补料方式可分为：连续流加

不连续流加 (少量多次、大量少次) 多周期流加

连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。 从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。

第六章 发酵染菌及防治

1、如何检查判断是否染菌？

溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸） 排气中CO2异常显示染菌

? CO2的含量变化是有规律的；

? 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加； ? 染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。 2、发酵染菌应从哪几个方面进行分析？

（1）根据污染杂菌种类分析 （2）根据染菌规模分析 （3）根据染菌时间分析

3、在工业生产中杂菌污染的途经及应采取哪些措施防止污染杂菌？

（1）种子带菌及预防

（2）培养基灭菌不彻底导致染菌及预防 （3）空气带菌及预防

（4）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及预防 （5）操作不当造成染菌及预防 （6）噬菌体污染及预防

4、工业生产中发现染菌应采取哪些措施？

（1）、种子培养期染菌的处理

①一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。

②采用备用种子，接入发酵罐继续进行发酵生产。

③如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产正常进行。 （2）、发酵前期染菌的处理

①如果培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌后，再接入种子进行发酵。

②如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。

③也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。 （3）、发酵中、后期染菌的处理

①可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。

②如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐。

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③对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min后才能排放。 （4）、染菌后对设备的处理

染菌后的发酵罐在重新使用前，必须进行彻底清洗并灭菌后才能使用；也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。

种子罐，灭菌前放水加温至100℃，加水量至少占罐体2/3，煮罐。 不用罐加热水浸泡 。

检查：A、罐体及附属设备是否渗漏； B、管道是否通畅； C、罐体有无污垢堆积； D、设备仪表管道安装是否合理； E、仪表是否失灵； F、过滤器是否失效。 （5）污染噬菌体处理

? 发酵液经灭菌后再放罐，严格控制培养液流失。 ? 清理生产环境，清除噬菌体载体——发酵液残渣。 ? 生产环境用漂白粉、新洁尔灭等消毒。

? 调换生产菌种。培养基中加草酸。噬菌体具有专一性。 ? 暂时停产1~4周，车间用甲醛消毒。 ? 选育抗噬菌体的新菌株。 （6）、其它处理

? 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道

灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌。

? 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用 甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲 醛蒸汽消毒。

? 发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，避免以后有类似情况发生，

并积极采取必要措施处理。

第七章 有机酸的生产工艺

1、柠檬酸的产生菌有哪些？

大规模生产中多采用黑曲霉和温氏曲霉。

石油副产品为原料，主要以假丝酵母属为生产菌种，其次为毕赤酵母、球拟酵母、汉逊酵母和红酵母属等。

2、柠檬酸合成途径有哪些？

(1) 由葡萄糖合成柠檬酸的途径：EMP、HMP、TCA。 (2) 由乙酸合成柠檬酸途径：TCA及乙醛酸循环。

(3) 以正烷烃为碳源时的合成途径：正烷烃→脂肪酸→乙酸→柠檬酸。 3、柠檬酸发酵工艺有哪几种？

（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。 （2）固体发酵：将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式 1）薄层发酵 2）厚层通风发酵

（3）深层发酵：菌体在液体培养基中，在通气条件下通过代谢转 化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。 4、柠檬酸分离提取的方法有哪些？

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