线虫RNA干扰的基因沉默

一、实验背景及目的

1、RNA干扰（RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单快速成为研究基因功能的有效手段。

2、秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。它具有生活周期短、易培养和保存等优点。秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。

秀丽线虫在20℃时生活周期为3.5天，25℃时约为3天，15℃时约为6天。受精卵经过胚胎发生孵化出L1、L2、 L3 、L4，最后成为成熟的幼虫。当食物缺乏或群体密度过大等环境不良的条件时，L2会不进入L3而成为dauer幼虫来抵御不良环境，当环境恢复后dauer幼虫不经过L3直接进入L4。因此可以利用该特性保存线虫品系。

3、RNAi是一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。

4、本实验将利用表达tag--214dsRNA大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag--214基因功能以及观察实验效果的目的。

二、实验材料及试剂 1、材料：

1） 秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型） 2） 大肠杆菌（E.coli）野生型菌株OP50 3） 带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株。 2、试剂：

1） NGM普通固体培养基

2）含有Amp+和IPTG的NGM固体培养基（用于RNAi） 3）LB培养基 4）M9缓冲液

三、实验操作

由于此次试验培养基配制以及大肠杆菌培养等的前期过程是由两个大组分

别进行的，我询问了第二大组的实验相关步骤，但还是会有纰漏，所以有些实验过程和实际的操作会有差错，有些细节也会省略。 1、配制NGM固体平板，M9缓冲液，LB培养基

具体配制所需要的成分和用量在实验书上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。

1）NGM普通固体平板每组需要配制500ml（实际上配少了），其中的细菌蛋白

胨为peptone。胆固醇以及磷酸钾缓冲液要在其他组分混合并且高温灭菌之后加入，统一倒平板，放置20h左右至表面干燥。

2）LB培养基中的胰蛋白酶冻是typtone，我们每组配制了500ml，121℃高压蒸汽灭菌。

3）Amp+为200mg/l tet+为100mg/l IPTG为1Mm ,均需要抽滤之后放入离心管中。

4）第二大组配制LB培养基（Amp+ tet+）NGM固体平板（Amp+）IPTG浓度为4mM。

2、大肠杆菌的培养

1）在NGM普通固体平板上划线培养大肠杆菌OP50

2）在NGM固体平板（Amp+ tet+）上划线培养大肠杆菌HT115(对照组和实验组)

3、大肠杆菌的活化

1）大肠杆菌OP50的活化：挑取少量的大肠杆菌OP50到LB普通液体培养基中，37℃振荡培养20h。之后铺到NGM普通固体平板。

2）大肠杆菌HT115的活化：挑取少量的大肠杆菌HT115(对照组和实验组)到LB培养基（Amp+ tet+）中，37℃振荡培养20h。

3）大肠杆菌HT115的再活化：吸取1mL的大肠杆菌HT115(对照组和实验组)到LB培养基（Amp+ tet-）中，37℃振荡培养20h。之后铺到NGM固体平板（Amp+ tet+）上。 4、rrf-3突变体的培养：

将线虫rrf-3突变体接种到含有大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上，20℃培养。

5、线虫扩繁（用到chunck）

选择线虫rrf-3突变体培养基中未受到污染而且线虫长势较好的部分切下一小块(手术刀蘸酒精，酒精灯烧，重复三次)，接到大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上。20℃培养（由于线虫长势问题，培养了接近三天） 6、线虫生长周期的同步化

1）取3mL的M9缓冲液加入到线虫rrf-3突变体的NGM普通固体平板，反复轻

轻地晃动平板，将平板上的线虫冲洗下来，然后将含有线虫的M9缓冲液转移到15mL的离心管中。

2）向离心管加入2mL的Naclo溶液和1mLNaOH(5mol/L)溶液，之后马上盖紧盖子剧烈晃动离心管。当发现溶液中的线虫身体呈现弯曲状，并且还没有出现絮状物时，加入M9缓冲液至15mL以终止反应。3000r/min离心1min。 3）弃上清，加M9缓冲液至15mL，3000r/min离心1min，重复。

4）弃上清，小心吹打沉淀，并将沉淀滴入未铺菌的NGM普通固体培养皿中央，20℃培养16-20小时。 7、收获L1幼虫及chunck

1)培养16-20h后，NGM平板上的线虫发育成L1幼虫。取500uL的M9缓冲液冲洗平板中的线虫，并将冲洗下的L1幼虫放到1.5mL的离心管中。将L1幼虫平均分为两份，分别接到大肠杆菌HT115(对照组和实验组)的平板中。20℃培养。 2)将培养线虫的培养基选择无污染且线虫长势较好的部分切下来一小块，接到OP50平板上，对照组和实验组分别接1个大板，普通的小板两个（培养线虫留着做后续的实验的）。 8、Single worm（挑单个虫）

睫毛依次蘸取Naclo 、70%乙醇、无菌水/M9缓冲液，在显微镜下分别挑取实验组和对照组的线虫，分别放在两个含有OP50的NGM固体培养板上，每个平板里两只线虫（我们有的平板里会多挑取一只）。 9、观察RNAi的表型和效率

第二天在显微镜下观察并且对实验组和对照组平板内的卵进行计数。

四、实验结果

这是我们计数得到的结果

虫卵数 接虫数

虫卵数/接虫数

1 35 2 17.5

对照组

2 81 3 27 实验组 1 2 3 1 2 2 1.5 0.5

我将对照组和实验组的虫卵数/接虫数取了平均值，并运用EXCEL做成了柱状图

进行明显的比较。