国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点

畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。

目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度 37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。

1 溶液配制

植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种, 即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。 1.1 乙酸缓冲溶液

国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用 的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH 3

COONa·H 2

O)=0.25 mol/l。

缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围 内的关键因素, 必须准确配制。 1.1.1 配制方法

称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml 容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期 检 测 技 术

475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。 1.1.2 注意事项

① 调节配制溶液 pH 值使用的酸度计应该是经

过校准, 且精度为 0.01; 所用复合电极必须在使用寿 命内。建议可以购买标准 pH 值的溶液进行验证。 ② 现行国标方法中用盐酸调节缓冲溶液的 pH

值。尽管文献报道, 用盐酸和乙酸调整 pH 值对酶活 性测定结果没有明显影响, 但考虑到缓冲体系为乙酸 缓冲溶液, 建议最好用乙酸调节 pH 值。

③ 尽管缓冲溶液在室温下可贮存 2 个月有效,

但贮存期超过 1 个月, 建议重新再确认 pH 值是否有

变化, 如果有变化, 需要重新调节 pH 值。另外贮存期 间容器要密闭。 1.2 植酸钠底物溶液 1.2.1 底物溶液的配制

底物浓度大小直接关系测定酶活性大小。国标 绝对法中植酸钠底物配制浓度为: c(C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12 )=

7.5 mmol/l,而实际反应液中浓度为 5.0 mmol/l,即样品管 中酶溶液 2 ml,底物溶液(7.5 mmol/l, 4ml),体系共 6 ml, 底物在该体系中的浓度为 5.0 mmol/l[(4×7.5)/6]。 底物溶液的配制: 准确称取 0.692 9 g 肌醇六磷 酸钠(C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12

) 于 100 ml 容量瓶中, 用乙酸缓冲

溶液溶解并定容至刻度, 用乙酸调节 pH 值至 5.50。 1.2.2 注意事项

① 选择适宜的植酸钠产品作为底物

目前, 作为底物用的植酸钠有两种型号, 一种是

Sigma p - 3168, 目 前 更 新 为 p - 0109, 分 子 式 为 C 6 H 6 O 24 P 6

Na 12 ·xH 2

O, 相对分子质量为 923.8( 不含水基 础), 另一种是 p- 8810, 分子式为 C 6 H 6 O 24 P 6 ·xNa + · yH 2

O, 相对分子质量为 660.03 (不含水游离酸基础)。 使用 p- 8810 做底物, 样品空白的吸光度较高, 例如标 示 5 000 U/g 活性植酸酶产品, 称样量约 0.2 g, 20 000 倍稀释后, 样品空白吸光度为 0.637, 样品管的吸光度 为 1.207。而同样一个样品使用 p- 0109, 样品空白吸 光度仅为 0.002, 样品管的吸光度为 0.545。但从我们 测定的酶活性结果来看, 前者要略高于后者。建议选 择 p- 0109 作为底物。

② 底物溶液一定要现用现配。

③ 注意植酸钠底物溶液 pH 值的调节。植酸钠作 为一种强碱性弱酸盐, 溶解于水后显碱性。尽管植酸 钠底物溶液是用 0.25 mol/l 乙酸缓冲液配制的, 但配 制后溶液的 pH 值不能保持在 5.50。我们实验室配制 完的底物溶液的 pH 测定值大约 6.3, 这与标准中植酸 酶活性单位定义所规定的条件不符合。所以配制完的 植酸钠底物溶液一定要用乙酸调节 pH 值至 5.50。这 一点非常重要, 否则会导致测定结果偏低。 1.3 显色终止液

植酸酶活性检测时, 定量测定的判定是通过试剂

显色后, 通过比色测定, 测定其 OD 值, 通过标准曲线 方法查得。显色终止液有两个作用: 终止反应和显色。 1.3.1 配制方法

① 100 g/l 钼酸铵溶液: 称取 10 g 钼酸铵[(NH 4 ) 6

Mo 7 O 24 ·4H 2

O] 于 100 ml 容量瓶中, 加入 1.0 ml 氨水 (25%), 然后用水溶解定容至刻度。 ② 硝酸溶液: 1+2 水溶液。

③ 2.35 g/l 钒酸铵溶液: 称取 0.235 g 钒酸铵 (NH 4 VO 3

) 于 100 ml 棕色容量瓶中, 加入 2.0 ml 硝酸 溶液(1+2), 用水溶解定容至刻度。

④ 显色终止液: 移取 2 份( 体积) 硝酸溶液, 1 份

( 体积)100 g/l 钼酸铵溶液, 1 份( 体积) 钒酸铵溶液混 合后使用。 1.3.2 注意事项

① 2.35 g/l 钒酸铵溶液避光条件下保存 1 周有 效。一般存放在棕色试剂瓶中。 ② 显色终止液一定要现用现配。 2 测定过程 2.1 样品提取

2.1.1 样品提取步骤

① 称取 0.1～1 g 样品于 150 ml 烧杯中,加约 40 ml 缓冲液,在磁力搅拌器上搅拌提取 30 min。如果样品为 包被植酸酶, 需要将样品进行研磨处理。具体做法为: 称取适量样品于研钵中, 滴加少量缓冲液体浸湿样 品, 进行研磨, 然后用缓冲液将其完全转移至烧杯中, 在磁力搅拌器上搅拌提取 30 min。

② 首先将样品摇匀, 快速移取 1 ml 样品于已知质

量 150 ml 烧杯中,准确称取样品质量,然后加约 40 ml 缓 冲液,在磁力搅拌器上搅拌提取 30 min。 2.1.2 注意事项

① 不要用曲别针或大头针等代替搅拌子, 防止 铁等金属离子对酶活性测定结果产生影响。 ② 搅拌提取过程注意搅拌速度不要太快, 防止 液体溅出和对酶活性产生影响。 2.2 样品液稀释

2.2.1 稀释倍数的确定

稀释倍数的确定主要依据主要产品推荐酶活性

或标示量、称样量和国标方法中要求的终酶溶液酶活

范围确定的, 终酶溶液酶活范围必须控制在 0.05～ 0.08 U/ml 范围。具体计算方法: ( 称样量×酶活标示 张丽英等: 国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点 检 测 技 术

48量)/终酶溶液酶活浓度。 2.2.2 注意事项

① 确保稀释准确性。植酸酶产品的酶活性比较

高, 典型标示量为 5 000 U/g。因此要想使终酶溶液酶 活控制在 0.05～0.08 U/ml 范围, 稀释倍数比较大, 所 以必须保证每一步操作准确无误。现以酶活性标示量 为 5 000 U/g 为例, 说明 20 000 倍稀释的一个比较简 单、有效操作方法。

准确称取 0.2 g 酶样品于 100 ml 高型烧杯中, 加 约 30 ml 的乙酸缓冲液, 在磁力搅拌状态下, 提取 30 min, 然后全部准确转移于 100 ml 容量瓶中, 并用 乙酸缓冲液定容至刻度。摇匀后, 用移液管准确移取 9 ml 的缓冲液于 50 ml 塑料离心管中, 取 1 ml 样品液 体于该离心管中,涡旋混合均匀,然后再移取 1 ml 于 另一只盛有 9 ml 缓冲液 50 ml 塑料离心管中, 涡旋混 合均匀, 做为终酶溶液进行测定。

② 如果酶活的标示量与实际含量相差很大, 比

色测定 OD 值超过 1.0, 反推算终酶溶液酶活浓度不 在 0.05~0.08 U/ml, 应该重新确定适宜稀释倍数, 重新 测定。不能看比色测定 OD 值是否落在标准曲线线性 范围内来计算结果, 否则会使测定结果偏低。 2.3 酶反应条件控制 2.3.1 温度控制

酶活测定过程中温度是非常关键因素, 植酸酶也 不例外。温度低或温度过高都会影响它的生物活性, 温度过高甚至会失去活性。因此在检测过程中对温度 控制显得非常重要, 国家标准方法测定温度要求控制 在(37±0.1) ℃。注意事项如下:

① 水浴锅的温度需要用标准温度计进行测量校 准。

② 水浴加热时, 水浴液面要超过试管内反应液 液面, 使其在规定的时间内充分反应。

③ 为了维持水浴的均衡, 最好采用循环水流, 或 振荡水浴。

2.3.2 反应时间控制

在酶活性定义中反应时间是一个非常重要的因

素, 如果各个反应管反应时间不一致, 就会导致测定 结果的偏高或偏低, 平行测定结果变异增大。整个反 应时间应严格控制在 30 min。为了确保获得精确的测 定结果, 减小测定结果的变异, 必须准确保证每一个

试管中反应时间一致, 必须注意以下几点: ① 采用实验室计时器进行准确计时。

② 等时间间隔加入底物和终止液, 而且时间间 隔要足够, 足以完成下一步骤所需要的时间。 2.4 离心和比色 2.4.1 离心

空白管和样品管都保持一致,离心速度为 4000r/min, 时间 10 min。 2.4.2 比色

酶反应结束后,在30~60 min 内离心,在波长 415 nm 条件下比色测定。 2.5 标准曲线

标准曲线是比色法测定的重要定量依据。制作标 准曲线所用的磷酸二氢钾一定按照标准要求采用基 准物级别, 不能用分析纯或优级纯代替。称量前要在 105 ℃烘干 3 h。制作的标准曲线相关系数应在 0.999 以上。

3 检测结果评价

检测结果是否准确、可靠、稳定主要可通过以下 几个方面进行衡量检验。 3.1 测定结果重复性

测定结果重复性主要是通过平行测定结果间相

对偏差大小来考证。标准要求两个平行测定结果的相 对偏差不能超过 8%。否则不能以平均值报告结果, 需 要重新测定。

3.2 测定结果的再现性

通过不同工作日或不同分析人员间分析结果的 比较, 来评价实验室测定结果的再现性。 3.3 测定结果的准确性

由于未知样品的真实含量很难知道, 所以要直接

检验测定结果的准确性非常困难。因此为了验证检测 过程是否产生偏离, 可以通过测定植酸酶标准样品来 评价。如果测定结果不在允许范围内, 应停止报告结 果, 查找原因, 重新测定。在实验室分析过程中, 存在 很多随机误差因素, 每批测定带一个标准样品是一项 非常有效的实验室质量控制措施。

植酸酶标准样品可以购买或实验室自己准备。为

了保证测定的准确度, 植酸酶标准品的赋值非常重要。 标定一个植酸酶标准样品至少需要 3 个国家权威质量 监督部门授权的国家级或部级认证的实验室。每个实 验室至少做 6 个平行测定, 每个平行内再设定 1 个重 复。将 3 个以上实验室测定的所有平行测定结果进行 统计处理, 计算出平均值, 以 2 倍标准差作为允许变 异范围。标准品需要在- 40 ℃条件下密封保存。

此外, 测定过程中要使用无磷水, 使用无磷洗涤 剂洗涤器皿, 减少磷的污染。

( 编辑: 沈桂宇, guiyush@126.com)

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