菌落总数检验操作规程
目 的：该操作规程用于规范公司产品及原料的活菌数量检验操作。 范 围：该操作规程适用于公司要求检查该项的产品和原料的菌落总数检验 责任人：微生物检验员，QC主管 内 容：
1 技术依据及原理
菌落总数计数采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一。
该方法以在琼脂平板上，样品经过处理在一定条件下培养后，所得1ml（或1g）检样中形成菌落的总数。测定结果只反映在规定条件下，只包括一群在平板计数琼脂生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。
在进行本法测定时，必须严格按本法规定的条件操作，以免产生实验误差。 2 材料、仪器、试剂的准备及基本要求 2.1 无菌室
2.1.1 结构和要求 无菌室面积不超过10m2，高度不超过2.4m，应采光良好、避免潮湿、远离厕所所及污染区，有缓冲间（2个）、操作间组成。
操作间与缓冲间之间应有样品传递窗（箱），出入操作间和缓冲间的门不应直对。 无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不得安装下水道。
无菌室照明灯应嵌装在天花板内，室内光照分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5W/m）, 紫外线杀菌灯距实验台面高度不超过1 m，并定期检查其辐射强度，辐射强度不低于70μW·cm-2 （1 m距离），不符合要求的紫外线杀菌灯应即使更换。
2.1.2 温度、湿度 无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外线杀菌灯的杀菌效果，故应控制温度18～26℃，相对湿度40～60%。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，压差不低于4.9Pa。
2.1.3 操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度应不低于10000级，局部净化度100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙
醇灯、打火机、大小橡皮乳头等。
2.1.4 缓冲间 缓冲间应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。
2.1.5 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌落或沉降菌数测定法。 洁净级别 ≥0.5μm尘埃数/m3空气 ≥05μm尘埃数/m3空气 活微生物数（个）/m3 100级 ≤3500 ≤0 ≤5 10000级 ≤350000 ≤2000 ≤100
沉降菌数测定
无菌室操台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30分钟，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48小时，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各一个，开盖，暴露30分钟后将盖盖上。在30～35℃
3
培养箱倒置培养48小时，取出检查，3个平板平均菌落数不超过1个。
无菌操作台或净化操作台要定期检测其洁净度，应达到100级，净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。
洁净级别 ￠90㎜、0.5h 100级 ≤1 10000级 ≤3 100000级 ≤10
2.1.6 消毒处理 无菌室应在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动净化装置，同时用紫外灯杀菌照射30分钟。
2.2 其他设备 净化工作台；恒温培养箱36℃±1℃、30℃±1℃；冰箱2℃～5℃、恒温水浴箱46℃±1℃；匀桨仪（8000～10000r/min）；和氏震荡器；恒温干燥箱（250～300℃）高压蒸汽灭菌器（定期检定）
2.3 菌落计数器、显微镜（1500X）或PetrifilmTM自动判读仪、电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.4 玻璃器皿 锥形瓶（容量250 ml、500ml）、培养皿（90mm）、量筒（100ml）、吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸头。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约
2cm的适宜疏松的棉花，置吸管桶或牛皮袋内。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞
或硅胶塞再用牛皮纸包扎，置180℃干热灭菌2小时或湿热灭菌121℃30分钟，烘干备用。
2.5 用具
2.5.1 大小橡皮乳头（放入干净带盖的容器中，并应定期用75%乙醇溶液浸泡）。 2.5.2 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
2.5.3 乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药勺、试管架、打火机、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）实验记录纸等。
2.6 试液 2.6.1 消毒液 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）；5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用），亦可选用其他适宜消毒液；75%乙醇溶液；碘酊或碘伏溶液。
2.6.2 稀释剂和试剂
无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 1mol/L氢氧化钠（NaOH）：称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。 1mol/L 盐酸（HCl）：移取浓盐酸90ml用蒸馏水稀释至1000ml。 磷酸盐缓冲液：
贮存液：称取磷酸二氢钾34.0g溶于500 ml蒸馏水中，用大约175ml的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，用蒸馏水稀释至1000 ml后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25 ml，用蒸馏水稀释至1000 ml，分装于适宜容器中，121℃
高压灭菌15分钟。
2.7 培养基
平板计数琼脂（Plate count agar,PCA）培养基 2.7.1 成分
胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 2.5g 葡萄糖 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000 ml
pH 7.0±0.2
2.7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15分钟。
培养基制备注意事项：
采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验，若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应 为化学纯以上。
配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。
培养基的分装量不得超过容器的 2／3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。
灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。已溶化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。
勿用电炉直接溶化平板计数琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏，应用水浴或微波炉加热。
2.8 供试品抽样、保存及检验量 2.8.1 抽样
2.8.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试）
2.8.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。
2.8.1.3 凡能从样品外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质，可直接判为不合格，无需再抽样检验。
2.8.2 保存
2.8.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏货冷冻，以防供试品内污染菌因保存不妥引起致死，损伤或繁殖。
2.8.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
3 检验程序 检验样品 25g样品＋225 ml稀释液，均质
10倍系列稀释
选择2个～3个适宜样品匀液
各取1ml分别加入无菌培养皿内
每皿中加入15ml～20ml 平板计数琼脂培养基，混匀
培养36℃±1℃
48h±2h
计算各平板菌落数
计算菌落总数
报 告
4 检验步骤 4.1 试验前准备
4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1nl、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必需事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
4.1.2 开启无菌室紫外灯和空气过滤器，并使其工作不低于30分钟。 4.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液其他适宜消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿无菌衣、帽、口罩、手套。 4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉（也可用乙醇棉）擦拭供试品瓶、盒、袋等的 开口处周围，待干后用灭菌的手术剪或镊将供试品启封。
4.2 供试品的稀释
4.2.1 称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌匀桨仪或匀浆杯内，8000～10000r/min均质1min～2 min，制成1﹕10的样品匀液。
4.2.2 取3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时一般操作为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸取，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂，试管塞立即塞上。