第二章
1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？ 1）MS培养基 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。
2）B5培养基 其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。 3）White培养基 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养 4）N6培养基 其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。
5）KM8P培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。
2、简要说明MS培养基的基本组成。 1）大量元素母液配制
MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4?7H2O）和氯化钾（CaCl2,CaCl2?2H2O）五种化合物。 2）微量元素母液配制
MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）组成MnSO4?4H2O、ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4?2H2O、CuSO4?5H2O、CoCl2?6H2O。 3）铁盐母液配制
MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO4?4H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2?EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。 4）有机母液的配制
MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。 5）激素母液配制
MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素
3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？
1）配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。 2）基本培养基中的大量元素、微量元素、维生素等一般都分别配制成母液。
4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？
1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。 缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。 2）过滤除菌 优点：
3）干热灭菌 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题
4）紫外线灭菌 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。
5）熏蒸消毒 优点： 方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
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6）药剂喷雾消毒
5、动物细胞培养常用的培养基组成成分有哪几类，在离体培养过程中有哪些作用？ 1）天然培养基 对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。
2）合成培养基 血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。
3）无血清培养基 细胞外基质能帮助细胞附着和铁壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。
6、初代培养时，接种的一般程序是什么？
1）在接种前打开超净工作台紫外灯照射20~30min，关闭紫外灯后，打开超净工作台的风机10min以上，开始无菌操作。
2）接种人员先洗净，在缓冲室内换好经过消毒的工作服，带上口罩，并换上拖鞋等。 3）上超净工作台后，用酒精棉球认真擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭工作台面及四周，装有培养基的培养器皿和盛外植体的烧杯也要用酒精擦拭消毒后，再放进工作台。 4）先用酒精棉球擦拭接种工具，然后在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌或放在接种器械灭菌器中灭菌，灭菌后放在器械架上使其自然冷却。
5）把植物材料放在75%乙醇中浸泡约30s，再用0.1%的升汞中浸泡5~10min，浸泡时刻进行搅动，使植物材料与消毒剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗3~5次。 6）接种时培养瓶瓶口要在酒精灯火焰附近，并在接种前后灼烧瓶口。 7）接种结束后，清理和关闭超净工作台。
7、配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用？ 植物激素是植物细胞生长最适宜的调节物质，它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。
8、什么是生物安全实验室？目前，生物安全实验室的种类有哪些，各有什么特点？ 1）生物安全实验室是指对由动物、植物和微生物等生物体给人类健康和自然环境可能造成不安全的防范，主要是针对病原微生物或具有潜在危害的重组DNA等生物危险的方法而建起的安全实验室。
2）BSL-1(P1) 对动、植物和环境危害较低、不会引发疾病
BSL-2(P2) 对动、植物和环境有中等危害或具有潜在危害的致病因子
BSL-3(P3) 可通过气溶胶使人传感上严重的甚至是致命的致病因子，对动、植物和
环境有高度危害；通常有预防治疗措施。
BSL-4(P4) 对动、植物和环境有高度危险性；通过气溶胶途径传播途径不明，没有
预防措施
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第三章
1.基本概念
细胞的全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。
外植体：是指由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus)
极性：通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。
细胞分化：是指发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。在细胞水平上，细胞分化是指细胞在形态、结构和功能上发生改变的过程。
去分化：已有特定结构和功能的植物组织，在一定的条件下，其细胞被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程叫脱分化或去分化（dedifferentiation)。
再分化：脱分化细胞失去了分化的特征，但在特定条件下，可再次开始新的分化发育进程，最终形成各种组织、器官或胚状体等，即再分化（rededifferentiation)
体细胞胚： (somatic embry)又称胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。
人工种子：（artificial seeds）又称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）。就是将离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。
2.愈伤组织的形成大致可分为几个时期？各有何特点？ 答：可分为三个时期：
（1）启动期 (诱导期)：主要是指细胞准备分裂的时期,需要采用合适的诱导剂,如NAA(萘乙酸)、IAA （吲哚乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等或细胞分裂素。
特征：距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质开始增多，相应的液泡缩小，核变大，呈球形，并由细胞边沿向中央移动；核仁明显变大，RNA含量增加，细胞恢复到具有分裂能力的状态，进入分裂的准备阶段，开始脱分化。
（2）分裂期：进入分裂期就是脱分化的完成，同时也是再分化的开始。
特征：被启动的细胞全面地进行活跃分裂。启动分裂的细胞体积变小，细胞内有旺盛的物质合成，并逐渐恢复到分生组织状态。如果此时经常更换培养液，愈伤组织就可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。
（3）分化期（形成期）：细胞内部开始发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。
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特征：这一时期与分裂期没有明显界限，一方面细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，另一方面细胞开始再分化。
3.愈伤组织有何生长特征？ 答：（一）生长特性 1、愈伤组织的类型
根据组织学外观特征及其再生方式分为：胚性愈伤组织（EC）：质地较坚实，颜色有乳白或黄色，表面具有球形颗粒，生长缓慢。又可分为：致密型、易碎型。
非胚性愈伤组织（NEC）：松疏易碎，颜色有黄色或褐色，表面粗糙，生长迅速。
一般只有胚性愈伤组织有再生能力。某些植物的非胚性愈伤组织经适当继代培养可转变为胚性愈伤组织。
4.外植体的发育程度对愈伤组织的诱导和继代有何影响？
答：在胚性愈伤组织的诱导中，外植体的发育状态是一个十分重要的因素。外植体在发育过程中，存在一个很短暂的时期，此期外植体内的某些细胞处于未分化或部分分化的状态，这些细胞具有形成胚性愈伤组织的能力，而处于这一发育时期之前或之后的外植体都只能形成非胚性愈伤组织。因此，选择适宜的取材时期可获得理想的培养结果。 5、培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？ 答：（1）有直接发生与间接发生两种途径。
（2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄
6、生理学说、遗传学说和竞争学说各如何解释长期培养物形态发生潜力丧失的现象？ 答：1．生理学说
随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部培养条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。 2． 遗传学说
该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。 3．竞争学说
首先，细胞对于生长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；
其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，
按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期
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之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。 7、离体培养条件下，茎、芽和根的再生方式有几种？
答:离体条件下植物细胞全能性实现的途径 ? 1、植物体细胞
? 2、植物性细胞 可诱导形成完整的植物体 ? 3、植物原生质体
4、融合的原生质体→可发育成杂种植物
5、转基因的植物细胞→可发育成具有新性状的植物体
8、影响器官发生的主要因素有哪些？
答:1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄
9、何谓胚状体？胚状体与合子胚有何异同？
答：胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。
异同 细胞胚具有两极性，而器官发生是单极的。细胞胚维管组织分布是独立的Y 字形结构，形成的再生植株遗传性比器官发生的稳定。 10、离体培养条件下，胚状体的产生有几种方式？
答：直接从外植体上产生体细胞胚 由愈伤组织产生 悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生 有悬浮培养中游离的单细胞产生 由单倍体细胞产生 11、胚状体的发育大约要经过哪几个时期？ 答：一、诱导期 二、胚胎发育期 12、影响胚状体发生的主要因素有哪些？ 答：因素：氮源 生长素 组织起源
13、如何区分离体培养条件下的不定芽与胚状体？
答：体细胞经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构，并与原外植体的微管组织无联系，是个相对独立的个体，区别于组织培养中以器官发生方式分化的不定芽和不定根。
14、目前研制的人工种子结构是怎样的？ 答：人工种子由以下三部分组成：
①具有良好发育的体细胞胚，并能发育成正常完整植株：广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞胚即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体组成。②人工胚乳，一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成，养分包括矿质元素、维生素、碳源及激素等。③胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。
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15、控制胚性细胞同步化的方法有哪些？
答：①抑制剂法促进细胞同步分裂；②低温处理促进细胞同步分裂；③渗透压控制同步化法；④同步胚的分段收集筛选法；⑤通气法。
16、人工种子繁殖体如何处理？人工种子的制备要点有哪些？
答：繁殖体的处理：①体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期储存。②微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长储存时间，需根据使用季节进行适当的休眠处理。③以微芽为繁殖体时，不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。
第十二章课后思考题（仅供参考）
1. 简述动物细胞培养的特点与营养需求
答：针对动物细胞培养的各种方法，相应的培养特点：
1、 转瓶（管）培养系统 （特点）优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。
缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制。
2、反应器贴壁培养 细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养基一起流动。（特点）优点：比较容易更换培养基，不需要特殊的分离和培养设备。缺点：扩大规模较难，不能直接监控细胞生长情况。
3、 悬浮培养法，主要用于非贴壁依赖型细胞的培养。如杂交瘤细胞、
淋巴细胞、和许多肿瘤细胞等。特点：用于实验室的普通悬浮反应器，是一种带有搅拌器的旋转瓶。
4、固定化培养，固定化培养是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。特点：具有细胞生长密度高，抗剪应力和抗污染能力强，细胞易与产物分开，利于产物分离和纯化。
针对与植物细胞培养的区别（即思考题7），动物细胞的培养有一下特点： a.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）
b.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。 c.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。
d.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。 营养需求：
①动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环
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境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。 ②动物细胞培养液的特点：液体培养基、含动物血清。
③动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。
2. 试述动物细胞培养在生物技术中的应用潜力
答：a.生物制品的生产，（酶、生长因子、疫苗和单抗） b.转基因动物的培养 （转基因鱼、转基因小鼠） c.检测有毒物质 d.医学研究
3、简述动物细胞工程技术应用的两面性。 答：
4、举例说明动物细胞培养的目的与用途。 答：
5、简述细胞冷冻的原理和方法。
答：主要冻存方法：超低温保存。
细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。快冻慢溶
6、接触抑制与密度抑制有什么异同。
答：接触抑制:细胞从接种到长满容器表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加——接触抑制。
密度抑制: 细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。
8、试举一例说明细胞建系的全过程（列出主要方法、步骤及所需的仪器设备）。 答：
9、试述动物细胞生物反应器的发展趋势。 答：
第四章
名词概念：
微繁殖：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。
繁殖系数：经一次增值培养或在一定时间段内由一个繁殖体所增殖获得的总繁殖体数或苗
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数。
玻璃化：也称超水化作用，是离体培养过程中试管苗发生形态、生理和代谢异常的现象。 褐变：是指组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成
棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。 原球茎：兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。
茎尖分生组织：指茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域，一般最大直径不超过0.1mm,长度0.25mm，最小的茎尖长度仅有几十微米，有时也称顶端分生组织。 不定芽：相对于顶芽和腋芽，由植物的其他部位或器官、组织上通过器官发生重新形成的、无固定着生位置的芽统称为不定芽。
2、植物离体无性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？
植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。 1周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。（2）占用空间小，不受地区、季节限制。（3）繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。（4）利物保持原来品种的特性。
3、离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有哪几种？各有何特点？ 离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有 4种。
1腋生枝型
特点（1）繁殖率高（2）能保持植物遗传稳定性（3）可缩短林木繁殖周期。 2不定芽型
特点：（1）繁殖率非常高，但繁殖速度较慢； （2）遗传性稳定。
3胚状体发生型
特点：（1）胚状体发生数量多，速度快，结构完整，繁殖系数高；（2）遗传性稳定。 4原球茎型是兰花种子萌发时产生的呈珠 粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，可萌发成苗
4、离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。 离体无性繁殖一般可分为5个阶段。
1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。 2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。
3、 培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球
茎等培养物的总量增加。
4、 生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮
的具有根、芽、茎的完整小植株。
5、 试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养
逐步适应温室或田间生长环境的过程
5 离体繁殖时外植体选择应注意哪些方面？
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生理状态和基因型 其中生理状态包括年龄、取材、季节、生长、环境部位
6 离体繁殖中常见得技术问题有哪些? 如何克服或防止其发生？ 污染问题和褐变、玻璃化
污染问题预防措施１）通风 ２）去湿３）光照４）防霉5）改进外植体消毒方法或使用抗生素
褐变防治措施1）选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。 2）合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。
（4）使用吸附剂：使用聚乙烯基吡咯烷酮 、0.1%-0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果
玻璃化防治措施1）降低细胞分裂素的浓度，调节激素配合2）增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的渗透势3）降低氨态氮，提高硝态氮的含量；4）增加容器的气体交换，降低容器内相对湿度5）降低培养温度，增加自然光照。6）在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质。
7 要提高某种植物离体快繁的效率，可以采取哪些措施？
8 试管苗与一般的种子苗相比有什么特点？ 试管苗的特点
①试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达。 ②试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用较差。 ③试管苗的叶片气孔数目少，活性差。 ④试管苗根的吸收功能弱。
9、脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？ 物理方法
（1）、高温处理又称热疗法
原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 ℃)即 钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害. (2)、低温处理又称冷冻疗法 原理：降低温度能使病毒活力下降。 化学处理
(1).病毒抗血清预处理 ： 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。
(2).RNA抑制剂处理： 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。
（3）.三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治动物RNA
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病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。
生物脱毒方法（原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒） （1）、茎尖分生组织培养 （2）、微体嫁接脱毒 （3）、愈伤组织培养脱毒 （4）、珠心胚培养脱毒 （5）、花药培养脱毒
10、简述通过茎尖分生组织培养脱除植物病毒的一般程序
选取感病程度轻的植株→分离大小合适的茎尖分生组织→茎尖分生组织培养→病毒检验 11、影响茎尖分生组织培养去除病毒的因素都有哪些？ （1）、供体的生理状态和部位 （2）、适当大小的茎尖分生组织的分离 （3）、茎尖分生组织培养基的类型和培养条件 12、无病毒植物的检测方法有哪些？ （1）、直接检测法:直接观察 （2）、电镜检测法 （3 ）、指示植物法 （4）、血清学检测法
（5）、分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术
13. 结合本章及前面所学的知识，你认为试管苗商业性生产中需要注意什么问题？ 答：进行试管苗商业性生产的企业在具备试管苗快繁生产技术、人员及相应的生产场地和设施等基本条件下，还应注意以下几点： （一）建立一套科学的试管苗生产管理体系 （二）试管苗生产要以市场为导向
（三）注重新产品、新技术的研发和创新、做好技术储备 14. 利用假期，实际了解当地植物快繁企业的生茶经营情况。 答：此题不考。
第五章
1. 分离植物单细胞的方法有哪些？ 答：有以下三种：
(一)机械法:主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。
(二)酶解法：主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。 (三)愈伤组织诱导法。
2. 植物单细胞培养的方法有哪些？各有何特点？ 答：1、平板培养法
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特点：单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害 2、看护培养
特点：简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察. 3、饲养层培养
特点：操作简便；不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成 4、微室培养法
特点：在培养过程中可连续进行显微镜观察；由于培养基少，水分难以保持，培养基的成分及pH等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。 5、液体浅层静置培养法
特点: 易于补加新鲜培养基、可以镜检
3简述植物细胞大规模培养反应器的类型及原理？ 分批培养、半连续培养、连续培养
4什么是细胞的悬浮培养？分批培养和连续培养各有什么特点？
悬浮培养:是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
5 在细胞悬浮培养中如何进行细胞生长量的计量？ 细胞生长量的测定一般方法有：
（1）细胞计数：在显微镜下记数，以cells/ml 表示单位体积里的细胞浓度
（2）细胞密实体积（PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。测定时，将细胞
离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。
（3）细胞鲜重或干重：过滤后直接称重为鲜重，干燥后再称得到的是干重。
（4）有丝分裂指数（MI）：是指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。
对于愈伤组织有丝分裂指数的测定一般采用富尔根染色法。对于悬浮培养的细胞则先离心，然后置于载玻片上用乙酸洋红染色并镜检。 6悬浮培养细胞同步化得方法有哪些？ 1、物理方法
(1)体积选择法: 将培养一段时间的细胞经过一定大小的筛网过滤,收集筛网上层的细胞;再经过较小孔径筛网上面的细胞.选择每一孔径筛网过滤得到的细胞分别再进行培养. (2)冷处理法: 收集细胞,在4℃温度下处理数天,添加新鲜培养液培养. 2、化学方法
(1) 饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。
(2)抑制法：通过向培养基中添加尿苷(1μg/ml),5-氟脱氧尿苷(2 μg/ml)等化学抑制剂抑制细胞分裂,可使培养细胞同步化。
(3)有丝分裂抑制法:在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水 7、简述细胞固定化的几种方法。
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答：1、包埋法 其中包埋法包括： （1）海藻酸盐包埋法 (2)k-卡拉胶包埋法 (3)琼脂糖 包埋法 (4)膜包埋法
2、吸附法 吸附法包括：（1）聚氨酯泡沫吸附法 （2）尼龙网膜固定法 （3）壳聚糖吸附法
8、在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？ 答：（一）筛选得到高产细胞系（株）常用方法有： 1、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群）
指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。 2、抗性选择
指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。 3、诱导选择
是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株） （二）培养条件 1适宜温度 2、不断调节PH
3、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。
4、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代谢产物合成都有一定影响。 5、通气量和搅拌转速 6、前体饲喂
7、诱导子的应用：诱导子是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径的物质，可分为生物诱导子和非生物诱导子。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物。
9、简述细胞活力鉴定的方法。
答：1、相差显微镜观察法 2、FDA染色法 3、伊凡蓝染色法
10、简述细胞计数的方法。 答：细胞生长量的测定一般方法有：
（1）细胞计数：在显微镜下记数，以cells/ml 表示单位体积里的细胞浓度。
（2）细胞密实体积（PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。测定时，将细胞 离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。
（3）细胞鲜重或干重：过滤后直接称重为鲜重，干燥后再称得到的是干重。
（4）有丝分裂指数（MI）：是指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。对于愈伤组织有丝分裂指数的测定一般采用富尔根染色法。对于悬浮培养的细胞则先离心，
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然后置于载玻片上用乙酸洋红染色并镜检。 第六章
1，目前用做原生质体分离的材料主要有哪些？它们各自有什么有优点？
答：原生质体的来源：(1) 来自各种植物的幼嫩的叶片、根尖，其中叶片由于取材容易而广泛采用。
（2）来自花粉，尤其是适合制备单倍体的原生质体。 （3）从组织培养产生的愈伤组织中获得
2、试述原生质体分离的方法和步骤
答：(1)机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割细胞壁,使原生质体流出或释放出来 (2)酶解法：常用的制备原生质体的酶包括；果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。 酶解法分：
顺序法（两步法）：先用果胶酶预处理，再用纤维素酶 直接法（一步法）：直接用果胶酶和纤维素酶 优点：获得量大，适用广泛。
缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。
3、影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析 答：供试材料的基因型和外植体
酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度、渗透压稳定剂 质膜稳定剂
分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间、分离用具
4、原生质体纯化主要有哪些方法？ 答：1、过滤-离心法
2、漂浮法：原生质体比重较小,能在具有一定渗透压的溶液(如25%的蔗糖溶液)中漂浮，然后用吸管收集。转入另一管中，如此反复离心、悬浮2~3次，即可获得纯原生质体。优点:制备的原生质体较纯净.。缺点:丢失的较多
3、界面法：又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。
优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时保持着相同的渗透强度使原生质体免受渗透冲击而受损。
5、为什么原生质体要培养在等渗培养基中？
答：只有培养在等渗培养基中植物才能正常生长 如果植物的原生质体培养在非等渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡， 所以植物的原生质
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体要培养在等渗培养基中。
6、原生质体培养中如何稳定培养基的PH？
答：分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。为了维持酶液的PH恒定，常用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液来配制酶液。此外，MES对保持酶解物的酸碱环境也有缓冲作用。
7、试分析影响原生质体培养的主要因素
⑴供试材料的基因型和外植体
⑵酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度 ⑶渗透压稳定剂 ⑷质膜稳定剂
⑸分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。 ⑹分离用具
8、原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？ ⑴液体浅层培养法： 优点：
原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：
原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 ⑵双层培养法——液体-固体双层培养法：
? 优点：
固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
? 缺点：
不易观察细胞的发育过程。 ⑶固体薄层培养法
? 优点：
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
? 缺点：
培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。 9、为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？
（1）原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以
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千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
（2）用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 10、原生质体融合要经过哪些过程？
1选择亲株 为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。
2原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。 3原生质体融合 早期的原生质体融合实验中，曾采用离心力作用使两种细胞的原生质体紧紧挤在一起以帮助融合，或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚，但这些方法的效果不佳。
4 原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。
11、PEG融合与电融合各有何特点？电融合的原理是什么？ PEG法特点：融合频率高；诱发融合无特异性；毒性较低 电融合特点：(1)融合率高、重复性强、对原生质体伤害小。 (2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程。 (3)免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。
电融合的原理：①交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。②施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 12、PEG融合法的技术关键是什么？电融合的关键技术是什么？ 13、对称融合与非对称融合的细胞杂交有何异同？ 14、体细胞杂交有哪些遗传特征？如何进行鉴定？
15.原生质体融合产物有哪些类型？ 答：自发融合、诱发融合
16.试述杂种细胞的选择方法？
答：一、互补选择法：（1）生长互补选择法 （2）营养缺陷型互补选择法 （3）抗性互补选择法 （4）细胞代谢互补选择法
二、机械选择法：（1）利用融合亲本的形态色泽上的差异筛选杂种细胞 （2）利用荧光素标记分离杂种细胞
（3）应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞
17.如何用分子生物学方法鉴定杂种植株？
答：（1）RAPD检测，是在DNA水平上迅速、有效的鉴定体细胞杂种的简便方法。
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（2）RFLP检测，具有种的特异性和遗传稳定性，能直接发现同源染色体上核苷酸碱基 序列的差异。
18.体细胞杂交有何意义？
答：（1）实现远缘杂交，形成新的物种。
（2）创造细胞质杂种。 （3）培育作物新种质和新品种。
19、体细胞杂交技术的应用现状及存在问题是什么？ 第七章
1、花药培养中如何选择外植体？
2、花药培养和花粉培养的区别是什么？
花药培养指用植物组织培养技术将发育到一定阶段的花药剥离下来（切去花丝部分），接种在培养基上进行培养，最终形成完整植株的技术
花粉培养：又称小孢子培养，或游离小孢子培养，指在无菌条件下，将花粉从花药中分离出来使其成为分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。
就培养材料而言，花药培养属于器官培养，花粉培养属于细胞培养。
3、花药培养过程中低温预处理的原理是什么? 低温处理的作用机理：
3、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育；
4、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。 4、花药培养时蔗糖和激素浓度如何选择？依据是什么？
5、 花药（或花粉）培养过程中决定再生植株倍性的因素有哪些?
6、 单倍体育种的方法有哪些？P159 单倍体育种 ①原理：染色体变异
②方法：花药离体培养获得单倍体植株，人工诱导染色体数目加倍。
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7.影响花药培养的因素有哪些？
答：一、基因型 二、植株的生理状态 三、培养基 四、预处理 五、培养条件 六、接种密度
8. 单倍体育种的意义是什么？
答：一、良好的遗传研究材料 二、加速育种进程 三、提高选育效率 四、突变体选育 五、遗传转化受体 六、利用单倍体育种对栽培品种进行纯化
9. 离体培养条件下小孢子是如何发育成完整植株的？
答：小孢子进行早期分裂，经多次分裂后形成多细胞花粉，其中，经胚胎发生的花粉粒最终会形成多细胞的球胚，并进一步发育成植株（如颠茄、芸薹、曼陀罗、天仙子、烟草等）。而不经胚胎发生的花粉粒则会经由器官发生途径分化出芽和跟，最终形成完整植株（如拟南芥、芦笋和黑小麦等）。
10. 如何对获得的花粉植株进行倍性鉴定？染色体加倍的方法有哪些？
答：倍性鉴定有直接鉴定法和间接鉴定法两大类，其中间接鉴定法分为1.植株形态观察法 2.细胞形态鉴定法 3.DNA含量测定 4.核体积测量法 5.生化与分子标记鉴定，染色体加倍的方法有1.小苗处理法 2.茎尖处理法 3.培养基处理法
11、植物胚胎培养
1.幼胚培养的关键技术是什么? 答:幼胚剥离（关键）
必须把胚从周围的组织中剥离出来。因为胚剥离的成功与否是幼胚能否成功的关键。 幼胚是一种半透明、高黏稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，因此在剥离时一定要注意保湿，无菌，且操作要迅速。
胚柄的存在对于幼胚培养能否成活及成苗率有重要影响。所以幼胚剥离时应带胚柄一同取出。
2.幼胚培养时胚的发育方式有哪几种?各有何特点? 答:幼胚培养时，生长方式有三种：
a、胚性发育：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚（有时甚至可能类似种子），然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株。这种途径发育的幼胚，一般一个幼胚将来发育成一个植株。
b、早熟萌发：幼胚接种后，不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，这种现象即称为早熟萌发。这种方式形成的幼苗往往细弱、畸形，难以成活。因此在幼胚培养中应防止早熟萌发。
c、产生愈伤组织：在幼胚培养中常能在追加生长调节剂时诱发愈伤组织产生、进而分化形成胚状体或不定芽。
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3.在实际操作中如何确定胚囊的发育时期? 答:
4.影响胚珠培养成功的因素有哪些?
答:1)材料选择 2)发育时期:已授粉具球形或此期以后胚的胚珠容易培养成种子。 未授粉胚珠培养以接近成熟期的八核囊或成熟胚囊为佳。 3)胎座组织 4)培养基
5.未授粉子房培养与授粉后子房培养有何不同? 答: 传粉和受精后的子房,仍需进行表面消毒后再接种
未授粉的子房可将花被表面消毒后,在无菌条件下直接剥取子房接种
6.植物胚乳有哪些类型?
答:①被子植物胚乳：双受精产物，属三倍体组织
②裸子植物胚乳：很特殊，在受精前就形成，是配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因而是单倍体组织。
7.胚乳培养取材的最佳时期是何时?
答:旺盛生长期是取材的最佳时期,在该期最容易产生愈伤组织,而且诱导率也较高.
(胚乳发展进程大致分为早期,旺盛生长期和成熟期)
8.试述离体授粉的操作步骤?
答: a 采集花粉:开花前一天或当天取花蕾或花药，表面消毒后，无菌收集花粉
b 剥离子房或胚珠:开花前1~3天对用做母本的花蕾去雄并套袋。七花当天或第二天采集花蕾、表面消母，无菌下去掉柱头和花柱，肃取胚珠或子房 c 授粉
9.离体受精有何意义?
答:离体授粉与离体受精的意义: 1、克服远缘杂交不亲合性 2、克服自交不亲和性 3、诱导孤雌生殖
4、双受精及胚胎早期发育机理的研究
10.离体授粉与离体受精有何区别?
答:离体授粉是指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠完成受精而结实的过程。由于从花粉萌发、到精卵细胞融合形成种子，直至种
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子萌发产生幼苗都是在试管内完成的，所以也称其为试管受精。
离体受精是指离体及人工控制的环境下，精卵细胞融合形成合子的过程。它包括配子的分离、雌雄配子融合和合子培养三个阶段。 第9章课后习题答案
1、什么是植物体细胞无性系变异？引起或影响植物体细胞无性系变异的因素有哪些？ 植物细胞、组织、器官在无菌条件下进行离体人工培养，经过脱分化和再分化过程，重新形成愈伤组织和完整植株时所产生的变异 称为植物体细胞无性系变异
因素：（1）自发突变，与培养物的遗传背景、外植体类型及培养类型有关，同时也受培养时间、培养及成分等因素的影响
（2）人工诱变，包括物理诱变和化学诱变。物理诱变就是利用X射线、γ射线、β射线、中子、激光、电子束、离子束、紫外线等物理因素辐射诱发变异。化学诱变是利用化学试剂诱发的变异。诱变剂包括碱基类似物，烷化剂，DNA分子结构插入物三大类。
2、试述植物体细胞无性系变异的遗传学基础？ 体细胞无性系变异的遗传基础：
（1）染色体组型变异，如出现多倍体和非整倍体。
（2）染色体结构变异，由染色体重排造成的基因丢失，或“关闭”一个能使其相应隐性基因产生表现型效应的显性等位基因等。 （3）基因突变
（4）DNA总量变异和DNA重复序列拷贝数的变异 （5）基因丢失 （6）DNA碱基修饰
（7）转座子的激活，由转座引起突变。 （8）基因重排
3、何谓生理适应性变异和后生遗传变异？
答：生理适应性变异是指由于某种外界条件存在而引起的性状变异，这种变异会随着特定外界因素的消失而消失。
后生遗传变异是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化，即指在细胞的发育和分化过程中，由于基因表达调控发生变化而引起的表型变异，并不涉及基因结构的变化。 4、植物体细胞无性系突变体筛选的方法有哪些？ 答：（一）从再生植株中直接帅选有用突变株
（二）对离体培养物的帅选1.直接帅选法（1）正选择法(2)负选择法 2.间接帅选法 （三）绿岛法
5、植物体细胞无性系突变体筛选的一般程序和原则是什么？
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答：体细胞无性系突变体筛选的程序：材料选择、预处理、预培养、诱发突变、突变细胞的筛选、细胞增殖与器官建成、突变细胞的遗传分析和鉴定。突变体筛选的一般原则：多种检测手段相结合，初筛与复筛相结合、离体筛选与常规育种相结合。
6、植物体细胞无性系突变体筛选有哪些应用价值？
答：1.在农业上的应用。在农业领域，体细胞突变体筛选主要集中在直接筛选与高产相关的农艺性状（如株型、干粒重、穗长、株型）、特定的农艺性状（如高蛋白、优质蛋白）和抗性品种（如抗病、抗旱、抗盐、抗除草剂等以及筛选间接的常规育种材料（如远缘杂种体细胞易位体系）等方面。2.在植物细胞大规模培养生产次生代谢物中的应用。植物细胞大规模培养是植物生产次生代谢物如药用成分、香料成分、花青苷或黄酮等色素的一条重要途径。 第十章
14. 试述常温限制生长保存的概念及常用的方法
常温限制生长保存的概念就是使培养物处于无生长或缓慢生长状态下抑制植物的生长，限制植物的生长，是转移继代的间隔时间延长。
常用方法有：高渗保存法、生长抑制剂保存法、低压保存法、饥饿法、干燥保存法、 15. 简述低温保存的方法及其原理
低温保存的方法就是正确的选择适宜低温。
原理：植物要生长必须有适宜的温度，温度降低以后，植物的生长速度就会受到抑制而减慢，老化程度缓慢，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的。 16. 试述超低温保存的基本原理，常用的超低温保存方法有哪些？
超低温保存的基本原理：在超低温（液氮）保存过程中，植物细胞内自由水被固化或企划，仅剩下不能被利用的束缚水，酶促反应停止，几乎所有的细胞代谢活动。生长都停止了，当解冻后，又能够恢复再生能力。
超低温保存的方法有：传统的降温冷冻方法、玻璃化保存法、包埋脱水超低温保存、包埋玻璃化法超低温保存。其中，降温冷冻方法包含了快速冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法、逐级冷冻法。
4、冷冻防护剂的主要种类有哪些？它们的生理作用如何？ 答：冷冻防护剂有渗透型和非渗透型。
渗透型生理作用：渗透型冷冻保护剂多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，打到保护的目的。
非渗透型生理作用：非渗透型冷冻保护剂能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。
5、简述超低温冷冻保存种质资源的基本程序。
答：超低温保存材料的选取→材料的预处理→降温冷冻及超低温保存→解冻→再培养→超低温保存后细胞或组织活力检测
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6、谈谈超低温保存的生物学意义。 答：
第十一章 植物的遗传转化技术（思考题） 1、植物基因转化的受体系统包括哪些？
答：包括：原生质体受体系统、悬浮细胞受体系统、生殖细胞受体系统、愈伤组织受体系统、胚状体受体系统、叶盘受体系统、整株活体受体系统。 2试述农杆菌Ti质粒基因转化的原理。
答：首先在下链25bp重复序列的右边界起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3’端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。T链必须横跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。
3植物基因转化的方法有哪些？各自的特点是什么？
答：1）农杆菌介导法：受体类型广泛，简单易行、周期短、转化频率高，转化体常出现“嵌合”现象，影响转化频率的因素相对较少等。2）病毒介导法：特点是 病毒增殖水平较高、增殖速度快，基因组较小，宿主范围广，易于纯化等。3）基因枪转化法：适用范围广、无宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便、快速等。
4）电激法5）PEG介导法：特点是成本低廉、效果稳定6）花粉管通道法： 特点是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品，直接得到转化的种子，受季节限制。7）显微注射法：特点是转化效率高，转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。 4. 在哪些水平上可以对转基因植株进行检测？方法如何？
答：（一）标记基因的检测。1.选择标记基因；2.报告基因。（二）目的基因整合水平的鉴定；1.PCR检测；2.电化学发光PCR技术；3.HRCA技术；4.Southern杂交。（三）目的基因转录水平上的检测；1.Northern杂交；2.RT-PCR。（四）外源基因翻译水平上的检测。1.ELISA检测；Western杂交。
5.什么是转基因植物？如何对转基因植物进行安全性评价？
答：转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物。目前对转基因植物的安全性评价主要集中在环境安全性和食品安全性两个方面。 6.试述转基因植物在农业生产上的应用。
在农业生产上的应用主要有：1.抗除草剂转基因植物；2.抗虫转基因植物；3.抗病转基因植物；4.抗逆转基因植物；5.改良作物营养质的转基因植物。
第十三章
1、什么是细胞融合？细胞融合的方法有哪些？
细胞融合是指两个或两个以上来源相同或不同的细胞合并成一个细胞的过程。 细胞融合的方法：病毒诱导融合、化学诱导融合和电融合 2 细胞融合的原理与技术要点是什么?
原理是两亲本细胞的质膜发生融合形成对同一的质膜
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3 根据当前细胞融合分子机制的研究进展，你认为有无可能实现利用基因转染得方式完成特定细胞的靶和融合？谈谈你的看法
4 试述杂交瘤技术生产MCAb的原理？
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 5 试述杂交瘤技术生产MCAb的主要技术过程？
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等 第十四章 1名词解析：
胚胎移植：是指对优秀雌性动物进行超数排卵处理，在其发情配种后，从其生殖道中取出发育到一定阶段的胚胎（早期胚胎）移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜(称为受体)的生殖道相应部位的技术。
超数排卵：在动物发情周期，用促性腺激素进行处理，诱发其卵巢上大量卵泡同时发育并排卵的技术称为超数排卵，简称超排。
同期发情：同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。
胚胎冷冻：将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静止下来并可在-196度的液氮中保存的一种方法。
体外受精：就是将哺乳动物精子和卵子在体外人工控制的环境中受精过程的技术。 显微受精：是指借助显微操作仪将精子注入卵母细胞来实现受精的过程。 克隆动物：动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。
性别控制：是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。
2、简述胚胎的质量鉴定及分级方法。 质量鉴定：1、形态学鉴定
评定的主要内容：①卵子是否受精；②透明带的规则性；③胚胎的色调和透明度；④卵裂球的致密程度；⑤卵周隙是否有游离细胞或细胞碎片；⑥胚胎体身的发育阶段与胚胎日龄是不一致。
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2、染色检查 1）荧光染色检查：
二乙酸荧光素染色（FDA）：活力越强的细胞显示出淡绿色的荧光越强；死亡或活力降低的细胞不发荧光或仅有微弱荧光
2）台盼蓝染色检查：有活力的细胞不着色，死亡细胞充满着台盼蓝着色颗粒。 3、体外培养法 分为四个级别：
A级：形态正常，卵裂球致密、整齐、清晰，发育阶段与日龄一致，无游离的细胞和液泡或很少，变性细胞比例小于10%。可用于胚胎移植。
B级：卵裂球稍微不匀，比较致密、整齐，可见一些游离的细胞和液泡，变性细胞比例占10%~30%。可用于胚胎移植。
C级：卵裂球不匀，变形，发育较慢，游离的细胞和液泡较多，变性细胞达30%~50%。 D级：卵裂球多数变形、异常，发育缓慢，变性细胞占胚胎大部分，约75%。
3、常用的胚胎采集方法有哪些？ 答：手术法
4、简述胚胎移植的方法及操作步骤
答: 胚胎移植的方法有手术法和非手术法两种，可根据受体动物品种及移植目的不同选择使用。
（一）牛的胚胎移植 1、手术移植
先将受体母牛做好术前准备。在右腹部切口，找到有黄体侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎，然后将子宫复位，缝合切口 2、非手术移植
（1）、非手术移植一般在发情后第6~9天进行，过早移植会影响受胚率。 （2）、在非手术移植中采用胚胎移植枪和0.25mL细管移植的效果较好。
（3）、将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。 （4）、非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生产殖道感染 （二）羊的胚胎移植 1、常规手术法
? 对受体羊进行常规手术，在乳房前的腹中线部做一切口，然后引出输卵管或子宫角。 ? 通常将发育在3.5天内的胚胎移入输卵管，发育到3.5天以后的胚胎移入子宫角。 ? 胚胎一般应移入有黄体一侧的子宫角内 2、简易手术法
? 用手术刀在母羊后肢内侧的鼠蹊部做1.2~1.5cm的切口，插入食指，找到子宫角，
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插入手术刀柄，用食指和手术刀柄夹出子宫角，然后用移植针进行移植。
3、非手术法
? 用阴道扩张器，将移植导管通过子宫插入到子宫角植入胚胎。此法尚不可靠，成功
率低。
4、腹腔镜法
? 先对羊进行全身麻醉，而后从腹部插入腹腔镜，用特制的镊子夹住子宫角，并将其
轻轻提起，然后将胚胎注入子宫角。
5、常用的胚胎冷冻方法有哪些？
答：冷冻方法：（1）常规(逐步降温)冷冻法（2）玻璃化冷冻法 （3）一步(快速)冷冻法
6冷冻胚胎的质量如何判定？
答：一、形态学鉴定 二、染色检查 三、培养鉴定 四、移植检验
7、 如何进行卵母细胞的体外培养?
答：卵母细胞的成熟培养系统可分为：开放培养系统、微滴培养系统和密闭培养系统。（未确定）
8、 简述精子体外获能的方法？
答：一、血清白蛋白法 二、高渗透法 三、卵泡液孵育法 四、Ca载体法 五、肝素法
9、试述胚胎的体外培养方法
10.试述动物克隆技术的原理？
答：只有具备细胞全能性和可逆性两个条件才能进行动物克隆。所谓细胞全能性是指细胞包含了个体的全套遗传信息；可逆性是指细胞具有回复到发育零点状态的潜能，在特定环境因素的调节下，可回复到受精卵状态，并可发育成一个完整的生物个体。
11、简述胚胎克隆的过程
12、如何看待克隆动物的伦理问题？P309
首先，违背了伦理学的自主原则，被克隆者作为人所享有的独特性被粗暴地剥夺了。 再次，克隆人违背了伦理学的平等原则。
最后，社会学上克隆人与供体者的关系，克隆人身份、地位、家庭观念、克隆人的权利、婚姻及克隆的不确定性等将是社会不稳定的潜在因素，还可能扰乱征程的进货规律，干扰性
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别比例等。
13、试述体细胞克隆动物的制作过程？
14、动物性别控制与鉴定的方法有哪些？
1、免疫学分离法:利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原 2、离心分离法：X精子DNA含量略大于Y精子。 3、电泳分离法：Y精子带负电荷略小于X精子
4、流式细胞分离法:用流式细胞分离器分离X精子和Y精子(DNA含量差异) 5、化学药品处理法：X、Y精子嗜酸碱性不同
胚胎性别鉴定
1、细胞生物学方法:主要是通过核型分析对胚胎进行性别鉴定 2、生化分析法——胚胎H-Y抗原检测法
3、分子生物学方法:主要是通过PCR扩增Y染色体性别决定区的Y基因(SRY)来进行胚胎性别鉴定.
4、X染色体相关酶分析法
2. 十五章课后习题
1. 干细胞和干细胞技术的含义是什么？
答：干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能长生至少一种高度分化子代细胞的细胞。 干细胞技术：
2. 按照细胞发育潜能可将干细胞分为几类？根据细胞来源可分为几类？ 答：发育潜能：全能干细胞，多能干细胞，专能干细胞
来源：成体干细胞：普遍认为成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化产生1种或1种以上子代组织细胞的末成熟细胞,如造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、生殖干细胞。
胚胎性干细胞：是一种全能干细胞，是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。能在体外进行培养、传代，并在一定条件下保持末分化的二倍体状态及其全能性，具有形成嵌合体动物的能力。 3、试述ES细胞和成体干细胞的的特点？
ES细胞：ES细胞一般是从发育早期的胚胎内细胞团中分离培养出来的一种具有自我更新、无限增殖能力、能分化成代表3个胚层组织细胞能力的干细胞，细胞直径为12~15微米，细胞集落特征明显。
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成体干细胞：成体干细胞的来源很多，包括造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞及表皮干细胞。成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分可以分化为至少2或3种以上其他的组织细胞。成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。 4、略
5、ES/EG细胞系的特征有哪些？P324
ES/EG细胞具有在体外无限或长期增殖和多向分化的潜能，能实现体外外源基团的导入和细胞嵌合，成为组织工程的一种理想种子细胞。ES/EG细胞系的特征如下：
15. 无限增值性：在不分化的前提下，ES细胞体外培养增殖迅速，每18~24h增值一次，细胞随着增殖次数的增加而活力并不减弱。
（四）分化潜能性：ES细胞是一种具有高度分化潜能的细胞，可以分化形成包括三个胚层在内的各种类型细胞。
? 种系传递性：将ES细胞注入囊胚后发育可获得嵌合体，并参与生殖细胞的形成。在嵌合体中一部分组织和细胞来源于受体囊胚细胞，而另一部分来源于ES细胞。
6.鉴定ES/EG细胞系的方法有哪些？ 答：ES/EG细胞的鉴定方法有以下几种 1.形态学特征
2.特异性标志分子的表达1）Oct-4 2）碱性磷酸酶 3）阶段特异性胚胎细胞表面抗原 4）其他表面标志分子 3.分化潜能的检测 4.嵌合体的形成
7.试述ES/EG细胞体外诱导分化的原理和方法，需要注意哪些问题？ 答：基本原理
(一)自发分化 自发分化是指ES/EG细胞在体外呈单细胞悬浮培养时，会形成由多种类型细胞线合的类胚体，在加入生长因子干预后能够增加某一类型细胞的相对数量。
(二)诱导分化 诱导分化是将ES细胞与不同类的细胞共培养或添加相应的生长因子能够诱导干细胞发生向单一类型细胞的定向分化。
(三)基因调控分化 基因调控分化是利用ES细胞的体外遗传特性可操作性，通过强化或抑制有些基因的表达来形成单一谱系所特有的基因表达形式，结合培养条件和诱导因子作用定向诱导ES细胞的分化。
方法:主要有基因外诱导和基因修饰
基因外诱导:1.诱导剂法2.序贯诱导法3.直接分化法
8.叙述干细胞技术,转基因技术,基因工程技术和细胞核转植技术之间的相互促进作用及在现代生物工程和医学工程中的应用前景. 答:略 第十六章
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16章
1.生产转基因动物的常用方法有哪些？各有何优缺点？
答：六种方法：（1）原核期胚胎的显微注射技术，优点：有外源基因长度不受限制，可直接用不含原核载体DNA片段的外源基因进行转移；实验周期相对较短。缺点：大动物原核胚的胚胎胞质中含有大量的泡状颗粒，影响其透光性，且显微操作技术含量较高，需要特殊的仪器并可能在注射过程中对胚胎造成损伤等；外源基因能否整合到受体基因组中，要等到子一代出生后经过选择才能确定，这对生育周期长，产仔少的大动物来说，效率就很低，而且整合位点随机，易造成宿主基因组内生命活动所必需的基因失活和导致胚胎或动物死亡；整合一般是指多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因结构、功能及表达调控。（2）反转录病毒技术，优点：感染率高，易转染，操作简单，而且多数为单拷贝，并可稳定的整合到可识别插入位点。缺点：反转录病毒作为载体，其插入的外源基因最大不能超过10KB，并且容易产生嵌合体。另外，插入的外干扰源基因容易丢失，反转录病毒本身的DNA序列也会干扰外源基因的表达。还有反转录病毒在安全方面仍存在问题。（3）慢病毒载体技术，优点：高效的转染率和转基因的高表达。缺点：插入外源基因需小于8.5kb和插入突变，经传代整合后所得原病毒DNA易发生甲基化，影响外源基因表达。（4）精子载体技术，优点：简单易行，直接可以用精子作为外源DNA载体进行基因转移。可以对大量的精子细胞进行处理，不损伤卵母细胞，在短时间内生产转基因胚胎，而且整合率高，成本低。缺点：结果不稳定，有的外源DNA并未整合到宿主的基因组中，而是以附加体的形式存在于染色体之外，由于存在于正常的细胞有丝分裂中，附加体丢失的概率很高。（5）体细胞核移植转基因技术，优点：动物转基因效率大幅提高，体细胞克隆技术可将基因整合和生产胚胎分开操作，有利于使用基因打靶技术。缺点：克隆技术的效率有待提高。（6）胚胎干细胞介导技术，优点：可以将外源基因整合到细胞的染色体组中，然后把这些干细胞经过筛选，找到理想的干细胞，大大减少了整合突变率，还可以消除随机整合产生的位置效应的影响。 2．显微注射法生产转基因小鼠有哪些步骤？需要注意哪些问题？
答：目的基因的准备，公母鼠的准备，受精卵的获取和培养，显微操作，卵的移植。卵母细胞受精后出现雌原核和雄原核，应挑选大而清晰的原核，这样可避免显微注射时对核仁的损伤，这对显微注射的成功与否非常重要。显微注射时应控制注射量，注射量不足影响整合率，但注射剂量过多时，容易引起卵膜破裂。 3.鉴定转基因动物的方法有哪些？ 答：
4.何为纯合子转基因小鼠？如何获得纯合子转基因小鼠？
经检测获得阳性Founder小鼠（首建鼠），然后将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经过扩大繁殖，从中选择外源基因表达效果好，适应性好的转基因小鼠进行同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系
5.基因打靶技术的应用范围有哪些？
（1）、研究基因功能;（2）、基因表达调控研究;（3）器官称植;（4）、人类疾病模型;（5）、
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基因药物开发;(6)动物品种改良。
6.基因打靶法联合体细胞核移植法生产转基因动物有何优越性？还有那些技术障碍？ 优越性：（1）、动物转基因效率大幅度提高;（2）、体细胞克隆技术可将基因整合和生产胚胎分开操作，有利于使用基因打靶技术;（3）、使用基因打靶技术，可以使消除基因位置效益，以达到高效表达的目的;两者相配合，将会大大促进这项技术的产业化，是未来生产动物乳腺反应器的希望和必然趋势。技术障碍：克隆技术的效率比较低，克隆胚胎移植后的流产率相当的高，有时高达80%。
7.何为乳腺生物反应器？应用范围有哪些？
所谓乳腺生物反应器是指目的基因在血液循系统或乳腺中表达的转基因动物。应用范围：生产高附加值蛋白质方面，如治疗性抗体、血清蛋白、营养蛋白和工业蛋白，抗出血性药物，抗凝血药物，血栓治疗药物，肺气肿治疗药物，免疫治疗药物，人源单克隆抗体的制备，乳汁成分的改造
第十七章
1 什么是染色体工程？动物染色体工程主要包括哪些方面的内容？
染色体工程是人们按照一定的设计,有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体,从而达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术.
动物染色体工程主要包括单倍体育种、多倍体育种、染色体的显微操作技术及人工染色体技术等。
2 动物染色体加倍主要有哪些技术？ 比较它们各自的特点及其适用对象？
凡雌核发育的个体,都具有纯母系单倍体染色体组，因此，雌核发育的生命力,依赖于卵子染色体组的二倍体化.
3什么是雌核发育？什么是雄核发育？分析雌核发育于雄核发育在动物单倍体育种中的作用？
雌核发育 俗称假受精:指精子虽然正常地钻入和激活卵子,但精子的细胞核并末参与卵球的发育,精子在染色体中很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。 雄核发育 是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理后的卵子与正常的精子受精,再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理,使进入卵子内的精子染色体加倍,而发育成完全为父本性的二倍体.
4 分析比较几种人工诱导雌核发育方法的原理及其特点？ 1、 精细胞的遗传物质失活
2、 阻止雌性个体染色体数目的减少 优点:廉价、易操作,也适合大规模生产使用. 关键技术:能否成功阻止第一次成熟分裂或第二极体的排出.
5如何鉴别雌核发育动物？
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(1)通常以颜色、形态和生化等方面的指标为根据. (2)通过细胞学的研究能精确地判别雌核发育的个体. (3)运用遗传标志的方法来鉴别、雌核发育的二倍体.
6简述多倍体动物的鉴别方法？
一、间接法包括1核体积测量(细胞核大小与染色体数目成比例)2蛋白质电泳3生化分析4形态学检查二、直接法包括染色体计数法和DNA含量测定（流式细胞仪）
7简述染色体转移的常用手段？ 一、微细胞介导的基因转移法 二、染色体介导转移法 三、细胞核融合转移法
8 何为人工染色体？它主要的构成元件是什么？ 人工染色体：是指人工组建的具有染色体功能DNA分子。
真核生物染色体的主要功能组成部分除基因外，还有3个关键序列： 1自主复制DNA序列(ARS):染色体复制所必须的。
2着丝粒DNA序列(CEN)：着丝粒是有丝分裂过程中纺锤丝连接的那 段DNA. 3端粒DNA序列（TEL):是保持细胞内线状染色体完整所必需。
9 酵母人工染色体如何构建？ 它在基因组研究中发挥了何种作用？
他们从酵母基因组中分离到了着丝粒、自主复制序列及一些标记基因，双从四膜虫的大核rDNA的末端分离到了端粒，然后将这三部分及标记基因连在一起就构成了YAC。
YAC是目前容量最大的载体。缺点：插入片段大，稳定性较差。
10讨论人工染色体的应用现状及其发展前景
应用（一）基因组物理图谱构建和图位克隆（二）基因表达调控及其功能的研究 （三）基因组分析（四）乳腺生物反应器研究（五）医学领域的基因治疗
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