成。当A肽与FDNB试剂反应后得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu以及Val）可给除DNP-His，在pH6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时全中性，另一种（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时带正电荷。问A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val] 解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-； 2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；

3、胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以Arg和Lys为C-末端残基的肽断。酸水解使Asn→Asp+ NH4+，由已知条件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-( )-( )-Val；

4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知条件（His、Glu、Val）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-His-Gln-Val；

5、糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由题，得到的一条肽（Asp、Ala、Tyr）结合（3）、（4）可得该肽的氨基酸序列为：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val

3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu- Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α- NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？[（1）4个肽；（2）-2.5单位；（3）如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得4个肽段；如果存在一个二硫键应得3个肽段并且个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置]

4、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂城两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？[它是一个环肽，序列为：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-] 解：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸，说明此肽不含游离末端NH2，即此肽为一环肽；

（2）糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，由已知两肽段氨基酸组成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-( )-( )-Tyr-和-( )-( )-( )-Phe-；

（3）由（2）得的两肽段分别与FDNB反应，分别产生DNP-Ser和DNP-Lys可知该两肽段的N-末端分别为-Ser-和-Lys-，结合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-( )-( )-Phe-；

（4）胰蛋白酶专一断裂Arg或Lys残基的羧基参与形成的肽键，由题生成的两肽段氨基酸组成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-( )-( )-( )-( )-Lys； 综合（2）、（3）、（4）可得此肽一级结构为：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-

5、三肽Lys- Lys- Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值，这种说法是否正确？为什么？[正确，因为此三肽处于等电点时，七解离集团所处的状态是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3个侧链3（1/3ε- NH3+）（pKa=10.53）(pKa=10.53),因此pI>最大的pKa值（10.53）] 6、一个多肽可还原为两个肽段，它们的序列如下：链1为Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg- Arg-

5

Val-Cys；链2为Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。（结构如下图） S-S

Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_Cys

S

S

Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys

解：嗜热菌蛋白酶作用专一性较差，根据题中已知条件： （1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链1在2位Cys 后及11位Val前发生断裂，2位Cys与12位Cys之间有二硫键；

（2）由链1序列可得该肽段序列为：-Phe-Pro-Lys-Arg-； （3）由（1）（2）可知该肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys来自链2，另一Cys为链1中8位Cys，即链1中8位Cys与链2中的一个Cys有二硫键；

（4）嗜热菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸残基，故此肽（Cys2、Phe）来自链2，结合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫键为链1 8位Cys与链2中3位Cys与链2中3位Cys之间；（4）中（Cys2、Phe）说明链2中1位Cys与5位Cys中有二硫键。

综合（1）、（2）、（3）、（4）可得结果。

7、一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物： NH4+ Asp Glu Tyr Arg Met Pro Lys Ser Phe 并观察下列事实：（1）用羧肽酶A和B处理该十肽无效；（2）胰蛋白酶处理产生两各四肽和游离的Lys；（3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母符号表示其序列位NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷；（6）一轮Edman降解给出下面的PTH衍生物：（图略）写出该十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro] 解：（1）用羧肽酶A和B处理十肽无效说明该十肽C-末端残基为-Pro；

（2）胰蛋白酶专一断裂Lys或Arg残基的羧基参与形成的肽键，该十肽在胰蛋白酶处理后产生了两个四肽和有利的Lys，说明十肽中含Lys-?或-Arg-?-Lys-Lys-?或-Arg-Lys-?-Lys-?Arg-Lys-?四种可能的肽段，且水解位置在4与5、5与6或4与5、8与9、9与10之间；

（3）梭菌蛋白酶专一裂解Arg残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生一个四肽和一个六肽，则可知该十肽第四位为-Arg-； （4）溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键，处理该十肽后产生一个八肽和一个二肽，说明该十肽第八位或第二位为-Met-；用单字母表示二肽为NP，即-Asn-Pro-，故该十肽第八位为-Met-； （5）胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两个三肽和一个四肽，说明该十肽第三位、第六位或第七位为Trp或Phe；

（6）一轮Edman降解分析N-末端，根据其反应规律，可得N-末端氨基酸残疾结构式为：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，还原为-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此为Ser； 结合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知该十肽的氨基酸序列为：

Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro

8、一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应

6

和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]

解：胰蛋白酶酶专一水解Lys和Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有强光吸收且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性，说明该肽段含Tyr和Arg；溴化氰专一断裂Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽段为-Met-Pro-；所以该四肽的氨基酸组成为Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。

9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为CNVRAPETALCARRCOOH，已知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应，（1）问此肽中存在多少个二硫键？（2）请设计确定这些（个）二硫键位置的策略。 [（1）两个；（2）二硫键的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一种情况，用胰蛋白酶断裂将产生两个肽加Arg；第二种情况和第三种，将产生一个肽加Arg，通过二硫键部分氧化可以把后两种情况区别开来。] 10、叙述用Mernfield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？

第五章 蛋白质的三维结构

提要

每一种蛋白质至少都有一种构像在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构像称为蛋白质的天然构像。研究蛋白质构像的主要方法是X射线晶体结构分析。此外紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、核磁共振和重氢交换等被用于研究溶液中的蛋白质构像。

稳定蛋白质构像的作用有氢键、范德华力、疏水相互作用和离子键。此外二硫键在稳定某些蛋白质的构像种也起重要作用。

多肽链折叠成特定的构像受到空间上的许多限制。就其主链而言，由于肽链是由多个相邻的肽平面构成的，主链上只有α-碳的二平面角Φ和Ψ能自由旋转，但也受到很大限制。某些Φ和Ψ值是立体化学所允许的，其他值则不被允许。并因此提出了拉氏构像，它表明蛋白质主链构象在图上所占的位置是很有限的（7.7%-20.3%）。

蛋白质主链的折叠形成由氢键维系的重复性结构称为二级结构。最常见的二级结构元件有α螺旋、β转角等。α螺旋是蛋白质中最典型、含量最丰富的二级结构。α螺旋结构中每个肽平面上的羰氧和酰氨氢都参与氢键的形成，因此这种构象是相当稳定的。氢键大体上与螺旋轴平行，每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，每个残基绕轴旋转100°，螺距为0.54nm。α-角蛋白是毛、发、甲、蹄中的纤维状蛋白质，它几乎完全由α螺旋构成的多肽链构成。β折叠片中肽链主链处于较伸展的曲折（锯齿）形式，肽链之间或一条肽链的肽段之间借助氢键彼此连接成片状结构，故称为β折叠片，每条肽链或肽段称为β折叠股或β股。肽链的走向可以有平行和反平行两种形式。平行折叠片构象的伸展程度略小于反平行折叠片，它们的重复周期分别为0.65nm和0.70nm。大多数β折叠股和β折叠片都有右手扭曲的倾向，以缓解侧链之间的空间应力（steric strain）。蚕丝心蛋白几乎完全由扭曲的反平行β折叠片构成。胶原蛋白是动物结缔组织中最丰富的结构蛋白，有若干原胶原分子组成。原胶原是一种右手超螺旋结构，称三股螺旋。弹性蛋白是结缔组织中另一主要的结构蛋白质。

蛋白质按其外形和溶解度可分为纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。α-角蛋白、丝心蛋白（β-角蛋白）、教员蛋白和弹性蛋白是不溶性纤维状蛋白质；肌球蛋白和原肌球蛋白是可溶性纤维状蛋白质，是肌纤维中最丰富的蛋白质。球状蛋白质是一类可溶性的功能蛋白，如酶、抗体、转运蛋白、蛋白质激素等，膜蛋白是一类与膜结构和功能紧密相关的蛋白质，它们又可分为膜内在蛋白质、脂锚定蛋白质以及膜周边蛋白质。

7

蛋白质结构一般被分为4个组织层次（折叠层次），一级、二级、三级和四级结构。细分时可在二、三级和四级结构。细分时可在二、三级之间增加超二级结构和结构域两个层次。超二级结构是指在一级序列上相邻的二级结构在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成的组合体。超二级结构有3中基本形式：αα（螺旋束）、βαβ（如Rossman折叠）、ββ（β曲折和希腊钥匙拓扑结构）。结构域是在二级结构和超二级结构的基础上形成并相对独立的三级结构局部折叠区。结构域常常也就是功能域。结构域的基本类型有：全平行α螺旋结构域、平行或混合型β折叠片结构域、反平行β折叠片结构域和富含金属或二硫键结构域等4类。

球状蛋白质可根据它们的结构分为全α-结构蛋白质、α、β-结构蛋白质、全β-结构蛋白质和富含金属或二硫键蛋白质等。球状蛋白质有些是单亚基的，称单体蛋白质，有些是多亚基的，称寡聚或多聚蛋白质。亚基一般是一条多胎链。亚基（包括单体蛋白质）的总三维结构称三级结构。球状蛋白质种类很多，结构也很复杂，各有自己独特的三维结构。但球状蛋白质分子仍有某些共同的结构特征：①一种分子可含多种二级结构元件，②具有明显的折叠层次，③紧密折叠成球状或椭球状结构，④疏水测链埋藏在分子内部，亲水基团暴露在分子表面，⑤分子表面往往有一个空穴（活性部位）。

蛋白质受到某些物理或化学因素作用时，引起生物活性丢失，溶解度降低以及其他的物理化学常数的改变，这种现象称为蛋白质变性。变性实质是非共价键破裂，天然构象解体，但共价键未遭破裂。有些变性是可逆的。蛋白质变性和复性实验表明，一级结构规定它的三维结构。蛋白质的生物学功能是蛋白质天然构象所具有的性质。天然构象是在生理条件下热力学上最稳定的即自由能最低的三维结构。

蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低构象的。折叠动力学研究表明，多肽链折叠过程中存在熔球态的中间体，并有异构酶和伴侣蛋白质等参加。

寡聚蛋白是由两个或多个亚基通过非共价相互作用缔合而成的聚集体。缔合形成聚集体的方式构成蛋白质的四级结构，它涉及亚级在聚集体中的空间排列（对称性）以及亚基之间的接触位点（结构互补）和作用力（非共价相互作用的类型）。

习题

1.（1）计算一个含有78个氨基酸的α螺旋的轴长。（2）此多肽的α螺旋完全伸展时多长？[11.7nm；28.08nm] 解：（1）α螺旋中每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm，故该α螺旋的轴长为：

78×0.15nm=11.7nm

(2) α螺旋每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，故该α螺旋圈数为：78÷3.6圈；α螺旋的直径约为0.5nm，故每圈轴长为0.5πnm。完全伸展的α螺旋长度约为：0.5π×（78÷3.6）≌34.01nm。

2.某一蛋白质的多肽链除一些区段为α螺旋构想外，其他区段均为β折叠片构象。该蛋白质相对分

-5

子质量为240000，多肽链外姓的长度为5.06×10cm。试计算：α螺旋占该多肽链的百分数。（假设β折叠构象中每氨基酸残疾的长度为0.35nm）[59%]

解：一般来讲氨基酸的平均分子量为120Da，此蛋白质的分子量为240000Da，所以氨基酸残基数为240000÷120=2000个。设有X个氨基酸残基呈α螺旋结构，则：

-57

X·0.15+（2000-X）×0.35=5.06×10×10=506nm

解之得X=970，α螺旋的长度为970×0.15=145.5，故α-螺旋占该蛋白质分子的百分比为：

145.5/536×100%=29%

3.虽然在真空中氢键键能约为20kj/mol，但在折叠的蛋白质中它对蛋白质的桅顶焓贡献却要小得多（<5kj/mol）。试解释这种差别的原因。[在伸展的蛋白质中大多数氢键的共体和接纳体都与水形成氢键。折旧时氢键能量对稳定焓贡献小的原因。]

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