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严密包装，专人送检

肛拭子、水样、细菌战剂如蛤蜊

检验方法－－显微镜检查：

涂片染色：标本直接涂片革兰染色，注意形态、排列 动力观察：压滴法或暗视野镜检，注意运动方式 制动试验：O1诊断血清与菌体结合，动力消失

分离培养：

将标本直接接种碱性胨水， 35℃ 6～8 h后，接种至TCBS平板或庆大霉素琼脂平板，35℃ 12h～18h出现可疑菌落：应使用Ｏl群和Ｏ139群多价和单价抗血清进行凝集，结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。

TCBS：出现黄色菌落

庆大霉素琼脂：出现中心灰褐色的菌落

生化反应：

粘丝试验：将0.5％去氧胆酸钠水溶液与霍乱弧菌混匀成浓悬液。lmin内悬液由混变清，并变得粘稠。以接种环挑取时有粘丝形成，弧菌属中除副溶血性弧菌的部分菌株外均有此反应。

氧化酶试验（+） 霍乱红试验：霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。当将霍乱弧菌培养于含硝酸盐的蛋白胨水中时，分解培养基色氨酸产生吲哚。同时，还原硝酸盐成为亚硝酸盐，两种产物结合成亚硝酸吲哚。滴加浓硫酸后呈现蔷薇色，是为霍乱红试验阳性。

0／129敏感试验：P82参照标准药敏试验的方法进行。将O／129(2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶)药敏纸片lOμg及150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板，35℃18～24h孵育后，纸片周围任何大小的抑菌环均表现为敏感。

耐盐培养试验：霍乱弧菌能在不含氯化钠和含6％氯化钠培养基中生长。氯化钠浓度高于6％则不生长。

确定血清群：O1群诊断血清与可疑菌落作玻片凝集，以确定是否为O1群 确定血清型：与分型诊断血清作玻片凝集，以确定血清型别 确定生物型： 第Ⅳ组噬菌体裂解试验 多粘菌素B敏感试验 鸡红细胞凝集试验 溶血试验 结果分析与报告：

霍乱属于法定的甲类传染病，一旦从病人粪便标本中分离出霍乱弧菌，需立即向上级管理部门报告。

3、对可疑霍乱患者应如何进行快速微生物学检查？

运动试验与制动试验（+）。

动力观察：采取病人―米泔水样‖大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌。

制动试验： 标本， 霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性。

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4、试述霍乱的防治原则。

⑴ 必须贯彻预防为主的方针，作好国境检疫与交通检疫，防止本病从国外传入；

⑵ 作好―三管‖ （水源、饮食物、粪便的卫生管理）工作，改善社区环境，以切断传播途径； ⑶ 疫苗预防接种，以提高人群免疫力；

⑷ 对霍乱病人应严格隔离治疗，必要时实行疫区封锁，以免疾病向外蔓延；

⑸ 对症治疗，抗菌治疗：①及时补充液体和电解质，预防大量失水导致的低血容量性休克和酸中毒是治疗霍乱的关键；②抗生素的应用：可减少外毒素的产生，加速细菌的清除。

5、临床上常用TCBS培养基分离哪些细菌？其菌落特征如何？

TCBS培养基（硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板）常用于选择分离弧菌属细菌，霍乱弧菌在其中可形成较大的菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色；而副溶血性弧菌形成不发酵蔗糖的绿色菌落。

6、副溶血性弧菌的主要生物学特性与所致的疾病。 主要生物学特性：

⑴ 革兰阴性杆菌，或微弯，单端鞭毛，无芽孢，无荚膜。

⑵ 营养要求不高，嗜盐性，最适盐浓度3.5％NaCl，无盐培养基不生长。 ⑶ TCBS：形成不发酵蔗糖的绿色菌落。 ⑷ 神奈川现象＋。

⑸ 抵抗力弱，不耐热，90℃1 min即被杀死。在水中生存不超过2天：耐碱怕酸，在50％食醋中1min死亡。

所致疾病：食物中毒，该菌经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传播，也可因食物容器或砧板生熟不分污染本菌引起。潜伏期5~72小时，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症，免疫力不强。

副溶血性弧菌鉴定

氧化酶阳性，O／129(150μg)敏感，发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸,不发酵蔗糖、乳糖。吲哚试验阳性，脲酶阴性，V-P阴性。 NaCI生长试验：该菌在不含NaCl和含10％NaCl的蛋白胨水中不生长，在含3%和7% NaCl蛋白胨水中生长。

赖氨酸脱羧酶、乌氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性。 神奈川现象阳性。

毒素测定：可用免疫学方法测定TDH和TRH。也可用基因探针和PCR方法直接测定毒素基因tdh或trh。

7、临床病例分析题

某患者因腹泻1天前来就诊。临床检查无腹痛，亦无里急后重感，体表凉；每天腹泻十几次，粪便外观呈稀水样，量多，逐渐呈灰白色水样便，伴呕吐；患者神志淡漠并感口渴。 (1) 此时需做何必要检查?

(2) 若TCBS平板上出现较大黄色菌落，如何进一步鉴定?

(1) 粪便标本直接涂片镜检、动力和制动试验：革兰染色阴性弧菌，呈穿梭样运动有助于诊断霍乱弧菌；直接荧光抗体染色和抗体凝集试验：应用01群和0139群霍乱弧菌的多价和单价抗血清进行凝集，可快速诊断霍乱弧菌感染；粪便标本碱性蛋白胨水增菌；粪便标本接种选择性平板，如TCBS、庆大霉素平板分离培养；霍乱毒素的测定。

(2) 氧化酶试验：霍乱弧菌应为阳性；血清凝集试验：挑选可疑菌落进行01群和0139群霍

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乱弧菌的多价和单价抗血清作凝集反应；生化鉴别试验：如霍乱红试验、粘丝试验、0/129敏感试验，其中包括古典生物型和EI-Tor生物型的鉴别试验等，如多粘菌素B敏感试验。

8、综合题

女，21岁，在欠发达地区工作，突发剧烈腹泻，不久开始呕吐，每日腹泻10多次，大便呈米泔水样。机体一般情况迅速恶化。急送医院，检查：病人脱水，血压为70/50mmHg（正常时为：120/80mmHg），脉搏快但弱。医师诊断为霍乱，并立即给予抗菌补液治疗。病情得以逐步好转。 问题：

⑴ 如何取样快速诊断证明病人为霍乱弧菌感染？

⑵ 如何进行病原菌的分离培养进一步证明是霍乱弧菌感染？ ⑶ 霍乱弧菌引起腹泻的毒力物质是什么？简述其结构。 ⑷ 该毒力物质引起腹泻脱水的关键机制是什么？

⑴ 采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴或压滴片，观察细菌动力，可见流星或穿

梭状运动的细菌。｛如条件许可，可进一步作制动试验（即标本+霍乱多价诊断血清，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制），阳性者可诊断。｝ ⑵ ① 标本采集：米泔水‖样便。

② 分离培养与鉴定：将标本直接接种碱性胨水， 35℃ 6～8 h后，接种至TCBS平板

（出现黄色菌落）或庆大霉素琼脂平板（出现中心灰褐色的菌落），35℃ 12h～18h出现可疑菌落，结合菌落特征和菌体形态与生化反应（粘丝试验、霍乱红反应等），最后使用Ｏl群和Ｏ139群多价和单价抗血清进行凝集，确定血清型，作出报告。

9、病历串型最佳选择题

某患者进食后发生恶心、呕吐、腹泻。 ⑴ 不应考虑的细菌是

A.福氏志贺菌 B.伤寒沙门菌 C.大肠埃希菌 D.金黄色葡萄球菌 E.链球菌 ⑵ 关于该菌生化反应，叙述错误的是

A.在3%、7%氯化钠中生长良好 B.在10%氯化钠中不生长 C.无氯化钠的培养基中生长良好 D.神奈川现象阳性 E.碱性蛋白胨水可做该菌增菌培养

⑶ 如果在患者粪便标本中分离到一种菌，革兰染色阴性；其生化反应结果是：氧化酶(+)，蔗糖(-)，动力(+)，吲哚(+)，脲酶(-)。则该菌可能是

A.福氏志贺菌 B.霍乱弧菌 C.大肠埃希菌0157:H7 D.副溶血弧菌 E.蜡样芽胞杆菌 ⑴ E ⑵ C ⑶ D

A.轮状病毒 B.鼠伤寒沙门菌 C.肠致病型大肠杆菌 D.肠产毒型大肠杆菌 E.肠出血型大肠杆菌 F.霍乱弧菌 G..痢疾志贺菌 H.空肠弯曲菌 下述临床表现，最可能由上述哪种病原体引起：

1. 一幼儿日前在5岁生日时得到一只宠物龟,之后出现低热、寒颤、头痛、恶心、呕吐、腹泻，粪便培养查到革兰阴性杆菌，该菌有动力，不发酵乳糖，硫化氢试验阳性。

2. 27岁女患者，新近从墨西哥返回，恶心、腹部绞痛、低热、大量水样泻。粪便标本查到可发酵乳糖的革兰阴性杆菌，此菌在伊红-美蓝琼脂上呈绿色。

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3. 9个月的婴儿出现严重水样泻及呕吐，病程持续5天，粪便标本未见致病菌、寄生虫及虫卵。

4. 一名在印度某水电站工作的44岁工程师，突发大量水样泻，由于每小时约0.5L液体的丢失，患者很快出现紫绀及重度脱水症状，肠鸣音减弱，低血压，血容量减少，其排出物呈等渗，暗视野显微镜检查，发现逗点状微生物。

5. 一个4岁女孩在随母亲旅游中，吃小店出售的汉堡包，回家3天后，出现剧烈腹部痉挛疼痛和多次血便，伴发热、呕吐。入院后检查有溶血性贫血及血小板减少等溶血性尿毒综合征。常规粪便培养发现有革兰阴性杆菌，有动力。

6. 一名5岁女孩因高热，意识模糊而入院，查体发现病孩面色苍白，昏迷，时有惊厥，两瞳孔不等大，呼吸微弱，粪检有脓细胞4个，白细胞数16×109/L，脑脊液正常。常规粪便培养发现有革兰阴性杆菌，无动力。 1. B 2. D 3. A 4.F 5.E 6.G

非发酵革兰阴性杆菌与其他革兰阴性苛氧菌

1、名词解释：非发酵菌；不动杆菌属；苛氧菌；卫星现象

⑴ 非发酵菌：是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的革兰阴性无芽孢杆菌。在分类学上分别属于不同的科、属、种，但生化反应相似，除不动杆菌和嗜麦芽寡氧单胞菌外，氧化酶试验均为阳性，多为条件致病菌。近年来由该类细菌引起感染的报告日益增多，已引起临床医学及检验医学的重视。

⑵ 不动杆菌属为一群不发酵糖类、氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、不能运动的G-杆菌（这三项试验均为阴性者在革兰阴性杆菌中极为罕见）。现已命名6个生物种，代表菌为醋酸钙不动杆菌；临床标本中，最常见的是鲍曼不动杆菌，其分离率仅次于铜绿假单胞菌。 ⑶ 苛氧菌是指对生长环境、营养要求比较苛刻，在一般培养基上不生长或难以生长，体外培养须添加特殊因子或其他营养成分才能生长的一类革兰阴性杆菌。

⑷ 卫星现象：由于金葡菌能合成V因子，可促进流感杆菌生长，故二者在血平板上共同培养时可出现离金葡菌落越近的流感杆菌菌落越大的现象，可用于流感杆菌的鉴定。

2、简述非发酵菌的初步鉴定特征（非发酵菌主要特点）。

若某种未知的G—杆菌具有以下一种或几种特征，则怀疑其为非发酵菌。 * 氧化酶：＋（不动杆菌属和嗜麦芽寡氧单胞菌除外） * O/F试验：O/－（氧化型或产碱型）

* 动力试验：多数为阳性 （黄杆菌科细菌除外）。有鞭毛，但在半固体培养基上观察动力试验不明显，故检测非发酵菌动力更准确的方法是采用30℃或室温12~14h培养物悬滴法。也可进行鞭毛染色鉴别某些有动力的非发酵菌。

非发酵革兰阴性杆菌鉴定较为复杂，必须先进行初步分群（菌属），然后再进行属中鉴定。初步分群常用的实验为葡萄糖氧化发酵（O/F）试验、氧化酶试验、动力观察。 菌属 假单胞菌属 不动杆菌属 产碱杆菌属 莫拉菌属 氧化酶 ＋ － ＋ ＋ O/F试验 O/－ O/－ － － 宜春学院医学院 杨婧编写

悬滴动力 ＋ － ＋ － 36