（3）用途 鉴定细菌能否产生尿素酶。 （十）Thornley 精氨酸培养基 （1）成分
L －精氨酸1.0g 蛋白胨 0.1g 氯化钠 0.5g K2HPO4 0.03g 琼脂0.3g 水100 ml 酚红0.001g （2）制法
① 将上述成分（酚红除外） 混合加热溶解后，校正pH 至7.0 ～7.2 ，加入酚红混匀，分装小试管。
② 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，备用。 ③ 同时配制不含精氨酸的培养基作为对照。
（3）用途 用于检测细菌能否产生精氨酸双水解酶，主要用于肠杆菌科，假单胞菌属及非发酵菌的鉴定。
（十一） 甘油品红培养基 （1）成分 牛肉膏10g 蛋白胨20g 水1000 ml 甘油1 ml
100g／L 碱性品红乙醇溶液0.2 ml
100g／L 无水亚硫酸钠水溶液（新鲜配制） 1.66 ml （2）制法
① 将牛肉膏、蛋白胨、水加热溶解后，校正pH 至8.0 ，加入甘油混匀。 ② 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，备用。
③ 临用时，加入碱性品红及亚硫酸钠液，分装试管。 （3）用途 鉴定沙门菌属细菌用。 （十二） 马尿酸钠培养基 （1）成分
马尿酸钠 1g
肉浸液（pH7.4）100 ml （2）制法
① 将马尿酸钠溶于肉浸液内，分装于小试管内。 ② 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后备用。 （3）用途 鉴定B 群链球菌用。 43.常用的生化鉴定试验有哪些? 一 、碳水化合物的代谢试验 （一） 糖类发酵试验 （1）原理
各种细菌含有不同的分解糖（醇、苷） 类的酶，分解糖类的能力各有不同，且不同细菌分解同一种糖的代谢产物也不一定相同。细菌分解糖类后形成的代谢产物随细菌种类而异，有的产酸，有的产酸产气。可根据糖分解的特性鉴别细菌。 （2）种类
种类很多。常用的单糖类有：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。双糖
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类有乳糖、麦芽糖、蕈糖等。多糖类有菊糖、淀粉、糊精。醇类包括甘露醇、甘油、侧金盏花醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇等。 （3）方法
细菌经分离纯化后， 根据待检菌的分解特性选择合适的含糖培养基，将纯种细菌接种该培养基中， 置温箱内培养数18-24小时，取出观察结果。 （4）结果
能分解糖产酸的细菌，培养基中指示剂是否呈现酸性反应。。不能分解该糖则无颜色变化。产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒置小管内出现气泡，固体培养基则出现裂痕。 （5）应用
糖分解试验是细菌生化试验中最常用的生化反应。可依据细菌分解糖的能力各异而区分和识别不同的细菌。如沙门菌能发酵葡萄糖，但不发酵乳糖，大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖。脑膜炎球菌能分解葡萄糖和麦芽糖，而淋球菌只能分解葡萄糖，不分解麦芽糖。 （二） 氧化－发酵试验（OF 试验） （1）原理
细菌在分解糖的过程中，根据有无分子氧参加，分为氧化型和发酵型。能在无氧环境中不能分解葡萄糖，称为氧化型。可进行无氧降解的，称发酵型。发酵型细菌在有氧和无氧的环境中都能分解葡萄糖。兼性厌氧菌为发酵型细菌。不分解葡萄糖的细菌称产碱型。 （2）方法
取2支HL(Hugh-Leifson)培养管,用接种针挑取少许纯培养细菌，穿刺接种至两支培养基的管底，将其中1 支在接种后加无菌液体石蜡或者凡士林在培养基表面，高度约1cm 。然后将两支培养管置35 ℃孵育48 小时后观察结果。 （3）结果
培养基由绿色变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，颜色不变表示不分解葡萄糖。两管培养基均变黄色为发酵型，若加液体石蜡的一管颜色不变而另一管变黄色为氧化型，两管均不变色为产碱型。 （4）应用
O F 试验可区分细菌的代谢类型， 有助于鉴别区分细菌。如肠杆菌科细菌都是发酵型细菌，绝大多数的非发酵菌为氧化型或产碱型细菌。葡萄球菌为发酵型而微球菌为氧化型。 （三） 七叶苷水解试验 （1）原理
七叶苷经细菌水解生成七叶素，七叶素能与培养基中构橼酸铁的二价铁离子结合生成黑色的化合物，使培养基变黑。
（2）方法 将细菌接种于七叶苷培养基上，在35 ℃孵育过夜。 （3）结果 细菌生长并使培养基变黑为阳性。
（4）应用 主要用于区分肠球菌、D群链球菌和其他链球菌，前两者阳性。也可用于革兰氏阴性杆菌和厌氧菌的鉴别试验。 （四） 淀粉水解试验 （1）原理
细菌产生淀粉酶可将培养基周围琼脂中的淀粉水解。加碘液后，菌落周围形成无色透明区。而琼脂中没分解的淀粉与碘作用产生蓝色。试剂可用卢戈碘液或革兰染液中的碘液。 （2）方法
将细菌划线接种或点种在淀粉血清琼脂平板或水解酪蛋白琼脂（M －H 琼脂）平板，经35 ℃培养过夜，在菌落上滴加碘液。 （3）结果
菌落周围出现透明区，而其他部位培养基呈蓝色为阳性。 （4）应用
某些细菌如白喉杆菌具有淀粉酶，本试验呈阳性，可用此试验鉴别细菌。 （五）β半乳糖苷酶试验
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（1）原理
某些细菌具有β半乳糖苷酶，该酶可分解邻－ 硝基苯－β－D － 半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻硝基酚。 （2）方法
用接种环在三糖铁培养基上刮取一环新鲜菌龄的菌苔，加于无菌盐水0.25 ml 中制成浓菌悬液，加入甲苯1滴，充分振摇， 将试管置于37 ℃ 水浴中5分钟， 加入ONPG 溶液0.25 ml ，在37 ℃水浴中保温，于20分钟、4小时、18小时和24小时观察结果。 （3）结果
出现黄色为阳性反应，不变色为阴性反应。通常在20 ～30 分钟内显色。 （4）应用
此试验是测定不发酵或迟发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶。由于细菌分解乳糖要有两种酶，一是半乳糖昔渗透酶，另一是半乳糖苷酶。当缺乏渗透酶时，乳糖不能进入细胞，乳糖分解就不能进行。这两种酶都是在乳糖存在的条件下诱导细菌产生。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 为阳性，如埃希菌属、枸橼酸杆菌属。不发酵乳糖的细菌为阴性，如沙门菌属、变形杆菌属。可用本试验作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。 （六） 甲基红试验 （1）原理
细菌在糖代谢过程中,能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸代谢为乳酸、乙酸、甲酸等,使培养基的p H 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色。某些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少，培养基酸碱度在pH 值5.4 以上，加入甲基红指示剂呈黄色。甲基红变色范围为pH 值4.0 ～6.0。 （2）方法
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置35 ℃培养2～4天。2天后取出部分菌液滴加2滴试剂，若为阴性结果，继续培养至4天再试。 （3）结果
红色为阳性，橘红色为弱阳性,黄色为阴性。 （4）应用
可鉴别肠杆菌科内各菌属。沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、埃希菌属为阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。较常用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的区别，前者阳性，后者阴性。 （七） VP 试验 （4）原理
某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步脱羧成为乙酰甲基甲醇。后者在碱性环境中被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰可与培养基中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。若培养基内含胍基太少，可加入少量肌酸、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反应。 （2）培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基。 （3）试剂
a.奥梅拉试剂：氢氧化钾40g 溶于水10 ml ，加肌酸0．3g 。
b.贝立脱试剂：甲液：6 ％α萘酚乙醇溶液。乙液：40 ％氢氧化钾。 （4）方法
a. 奥梅拉法：将细菌接种在上述培养基内，置35℃ 培养48小时。在培养液2 ml
中加入奥梅拉试剂0.2 ml ，置50℃水浴中2小时或37 ℃4小时，充分振摇，观察结果。
b. 贝立脱法：接种及温育同上。在培养液2 ml 中加入贝立脱试剂甲液1 ml 及乙液0.4 ml ，混合后置37℃中30分钟观察结果。如为阴性应继续置37℃4小时再观察。 （5）结果 呈红色为阳性。 （6）应用
常与甲基红试验一起使用。可区别肠杆菌科细菌。本试验阳性， 甲基红试验阴性，反之亦然。大肠埃希菌VP阴性而产气肠杆菌阳性。
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注：试剂甲液在室温阴暗处可保存1 个月，乙液可长期保存。 （八） 甘油复红试验 （1）原理
细菌分解甘油产生丙酮酸，丙酮酸脱羧而为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，显紫红色。 （2）方法
将细菌接种于甘油复红肉汤培养基，在35 ℃培养8天， 每天观察结果。将未接种的培养基在35℃培养，作为对照。 （3）结果
紫色为阳性（＋＋），紫红色为阳性（＋），与对照管颜色相同为阴性。 （4）应用 主要用于沙门菌属菌种间的鉴别。 二 、蛋白质和氨基酸的代谢试验 （一） 吲哚（靛基质） 试验 （1）原理
有些具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）试剂
柯凡克（Kovac）试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g ，戊醇75 ml ，浓盐酸50 ml 。将对二甲基氨基苯甲醛加入乙醇内， 振摇使溶， 徐徐加入浓盐酸， 边加边摇即成。
欧氏（Ehrlich） 试剂：对二甲基氨基苯甲醛4g ，95 ％乙醇380 ml ，浓盐酸80 ％ml 。配法与柯凡克试剂相同。 （3）方法
将细菌接种于蛋白陈水培养基中，置35℃培养1 ～2 天，沿管壁徐徐加入柯凡克试剂或欧氏试剂0.5 ml ，试剂浮于培养基之上，使成两层，即刻观察结果。 （4）结果
两液面交界处呈现红色为阳性，无红色为阴性。 （5）应用
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
注：有些细菌产生吲哚量少，需用乙醚或二甲苯提取后才能与试剂起反应。如黄杆菌。 （二） 硫化氢试验 （1）原理
某些细菌分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸） 生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。 （2）方法
将细菌接种于醋酸铅培养基或克氏铁、三糖铁琼脂培养基中，置35℃培养24～48小时，但惟赫夫尼亚菌需培养7天。每天观察颜色变化。 （3）结果
醋酸铅培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。KI 或TSI 琼脂在底层和斜面交界处出现黑色沉淀为阳性。 （3）应用
主要用于肠杆菌鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属硫化氢试验阳性，但沙门菌属中也有部分菌为阴性。此外，腐败谢尔瓦菌是非发酵菌中唯一能产生硫化氢的细菌。
（三） 尿素酶试验 （1）原理
某些菌能产生尿素酶，此酶能分解尿素形成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。 （2）方法
将细菌接种于尿素培养基，置35℃过夜培养观察结果，阴性反应者应观察4 天。
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