慢病毒收毒及纯化标准操作细则

1. 目的：

规范慢病毒收毒及纯化标准操作程序

2. 范围：

适用于慢病毒收毒及纯化操作工序

3. 操作程序 3.1 器材准备

无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、50ml离心管，移液枪、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜, 15ml超滤管、0.22μm滤膜、50mL无菌注射器、1mL无菌注

射器,离心机

3.2 溶液准备

OMEM培养基,1640培养基，FBS（gemini）

3.3 操作步骤

3.3.1收集转染后48小时的细胞上清液于一个50ml离心管中，并更换10mL新的1640培养基，72小时（从转染开始计时）后再收集一次，并混合到一起。

3.3.2 4000rpm，离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤收集好的上清液到新的50ml离心管中。

3.3.3准备一个15ml的超滤管，将过滤收集的上清液，根据上清液毫升数，分批次加入超滤管中（每次大约加入5ml）进行离心，4000rpm，离心10-15分钟，根据具体情况调整离心时间。

3.3.4每离心完成一次后，把管底部的废液弃掉，再加入新的上清液继续离心，最后一次离心完后，超滤管中保留500ul左右的病毒液，然后用移液器反复吹悬超滤管中病毒液，转移到无菌的EP管中。 3.3.5收集重悬后的慢病毒浓缩液于1.5mL离心管中，并做好标记，以10000rpm离心5min，以进一步去除其他杂质颗粒。

3.3.6用一支2mL注射器收集离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤于另一支干净的1.5mL EP管中，做好标记。

3.3.7根据需要将过滤后的样品进行小体积（50μL或20μL）分装，保留部分样品～20μL用于滴度检测，并做好标记，贴好标签。填写入库记录，并将分装好的病毒进行入库，保存于-80℃冰箱。

3.4清场

3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。

3.4.2操作室台面用75%酒精擦拭消毒后，开启紫外灯进行灭菌。