新生儿溶血病(HDN)实验室检查

一、父母及新生儿血型鉴定

目的：研究父母、新生儿血型与新生儿溶血病的关系

原理：用已知的IgM类特异抗体与受检红细胞在室温条件下、盐水介质中反应，根据红细胞是否出现凝集来测定受检者细胞膜上有无与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定受检者的血型。

器材：小试管、记号笔、试管架、离心机、玻片、显微镜

试剂：标准抗A、抗B血清、单克隆IgM型RhD抗血清（商品试剂）生理盐水 标本：抗凝静脉血或末梢血

实验步骤：制备受检者5%红细胞生理盐水悬液：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取管底下层的红细胞大约10滴于小试管中，加入生理盐水2ml，充分混匀红细胞与生理盐水。2500r/min离心3min后弃上清液，重复洗涤3次。自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水混匀，此即为5%的红细胞生理盐水悬液。 1、玻片法

（1） 取洁净的玻片1块，用记号笔画出小格，标明A、B、D

（2） 在玻片已标记的区域内滴加抗A、抗B血清、RhD抗血清各1滴

（3） 在滴加抗血清的小格中分别加入受检者5%红细胞生理盐水各1滴；不断

轻轻转动玻片，使抗血清与红细胞充分混匀，持续约1~5min （4） 观察并判断结果 肉眼观察有无凝集或溶血反应，再用低倍镜观察，判断

阴性、阳性和阳性强度。 2、试管法

（1） 取小试管3支，分别标记A、B、D

（2） 分别滴加抗A、抗B血清、RhD抗血清于相应标记的试管中 （3） 分别滴加受检者5%红细胞生理盐水悬液1滴于试管中，混匀 （4） 以1000r/min离心1min

（5） 观察并判断结果 取出试管，先观察上层清液有无溶血现象，再将试管轻

轻摇动使沉于管底的红细胞浮起，肉眼观察有无凝集及凝集强度。 注意事项：

1、器材：所用器材必须干燥洁净、防止溶血；为避免交叉污染，试管、尖滴管均一次性使用。

2、试剂：分型血清质量性能应符合合格实际要求。 3、标本：受检红细胞标本新鲜，无细菌污染。

4、标准抗血清从冰箱取出待其平衡致室温后在使用，用毕后应尽快放回冰箱保存，减少细菌污染。一般先加抗血清，再加红细胞悬液。

5、红细胞悬液浓度应适当，过高或过低使抗原抗体比例不当，反应不明显，易误判为阴性。

6、离心时间和速度要准确，以防止出现假阳性和假阴性结果。

7、观察凝集：①玻片定型时，转动玻片动作要轻，注意防止悬液干涸，以免将玻片边缘红细胞的凝集误认为是抗原抗体反应凝集。②玻片法反应时间不能少于10分钟，否则减弱的凝集不出现，造成假阴性 ③观察结果应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝集以及缗钱状形成的区别

二、孕妇血清IgG抗A（B）效价检测

目的：研究“O”型孕妇血清IgG抗A（B）效价与新生儿溶血病（HDN）的关系。 原理：准确检测孕妇血清IgG抗A（B）效价，可为HDN产前诊断、预防和及时治疗提供依据。微柱凝胶技术是建立在传统血型血清学基础上的一项免疫学检测技术，其基本原理是游离红细胞和凝聚红细胞是否能通过具有分子筛作用的凝胶介质。使用二巯基乙醇破坏孕妇血清中的IgM抗体后，采用微柱凝胶技术对IgG血型抗体的效价进行检测。

试剂和仪器：0.2 mol/L二巯基乙醇、ABO标准细胞、抗人球蛋白试剂；微柱凝胶检测系统：包括免疫微柱孵育器、血型血清学离心机、微柱凝胶卡；2200型离心机。 操作：

1、孕妇待检血清与0.2 mol/L的二巯基乙醇在试管内等量混合、加盖，放入37℃水浴1 h后进行倍比稀释。

2、依次将倍比稀释血清50 μl分别加入标记的微柱凝胶抗人球蛋白卡中，在所有孔中加入50 μl A型或B型0.5%红细胞悬液后37℃孵育5 min，用专用离心机离心5 min并观察结果。 3、判断结果 红细胞凝集位于凝胶表面或凝胶中为阳性结果，红细胞完全沉降到管底为阴性4、结果，参考值为<1∶64。

注意事项 微柱凝胶技术具有结果准确、敏感度高、标本用量少和操作简便等优点。

三、溶血三项实验：

一、婴儿红细胞直接抗球蛋白试验

（1）实验目的 检测新生儿红细胞上是否存在不完全抗体。

（2）实验原理 不完全抗体多与其相应的红细胞结合，在盐水介质中不出现凝集反应。Coomb试验利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，通过连接致敏红细胞表面的特异性Rh抗体，使致敏红细胞出现特异性凝集。

（3）器材 试管、记号笔、玻片、显微镜

（4）试剂 IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液、正常人2%~5%红细胞悬液、 抗球蛋白试剂

（3）标本 抗凝静脉血或末梢血

（4）操作步骤

1、取三只试管，表明待测标本管、阳性对照管、阴性对照管；

2、待测标本管加入1滴2%~5%婴儿红细胞悬液，阳性对照管加入IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液，阴性对照管加入1滴正常人2%~5%红细胞悬液； 3 、各管加入抗球蛋白试剂2滴，混匀，1000r/min离心1min；

4 、判断结果 斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，肉眼观察红细胞凝集情况。若有可疑的，可讲混悬液倒在玻片上，在显微镜下观查结果。如阳性对照管出现凝集，阴性对照管不出现凝集，说明被检测管的结果可信；若被检测管出现凝集，为RhD阳性，反之为RhD阴性。

5、报告方式 直接抗球蛋白试验阳性或阴性。

（5）注意事项：假如红细胞上的血清蛋白未被洗净，剩余的游离球蛋白可以中和加入的抗球蛋白抗体，产生假阴性抗球蛋白试验结果。 若为阴性结果，再加1滴25IgG抗体致敏的质控红细胞，离心观察结果，如凝集表明阴性结果是正确的；如不凝集，则阴性结果不可靠。

二、婴儿血清中游离抗体检查

（1）实验目的 检测新生儿血清中是否存在不完全抗体。

（2）实验原理 不完全抗体多与其相应的红细胞结合，在盐水介质中不出现凝集反应。Coomb试验利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，通过连接致敏红细胞表面的特异性Rh抗体，使致敏红细胞出现特异性凝集。 （3）器材 试管、水浴箱、离心机、

（4）试剂 谱红细胞、生理盐水、抗球蛋白试剂、IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液

（5）标本 抗凝静脉血或末梢血

（6）检测方法 有酶介质法、聚凝胺试验、间接抗球蛋白试验、人源盐水介质抗D试验、低离子强度溶液实验等。

间接抗球蛋白试验操作步骤 ：

1、谱红细胞1滴加入试管中，再加入婴儿的血清2滴 ， 混匀； 2、温育 37℃温育30~60min； 3、离心 以1000r/min离心1min；

4、观察 观察是否有溶血和凝集，并记录结果；

5、洗涤红细胞 用生理盐水洗涤3~4次。最后一次洗涤后，倒掉全部的盐水，加抗球蛋白试剂2滴，充分混匀；

6、离心 以1000r/min离心1min；

7、观察 轻轻悬浮细胞，观察有否溶血和凝集，溶血和凝集为阳性，否则为阴性； 8、复核 阴性者应加IgG抗D抗体致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液，离心并观察结果：凝集表示阴性结果可靠；不凝集表示试验无效，必须重做。 9、报告方式 间接抗球蛋白试验阳性或阴性。 三、婴儿红细胞抗体释放试验

（1）实验目的 检测新生儿红细胞上的致敏的血型抗体。

（2）实验原理 利用特殊的方法将致敏在新生儿红细胞上的抗体放散下来，然后再检测放散液中的抗体。只有当放散液中检出抗体，同时新生儿红细胞上又存在相应抗原是才认为释放实验是阳性。

（3）器材 试管、玻璃纸、离心机、水浴箱、记号笔

（4）试剂 生理盐水、乙醚、谱红细胞、放散液、抗球蛋白试剂 （5）操作步骤

1、取洗涤后婴儿压积红细胞1~2ml于试管中，加等量生理盐水和双份乙醚，用玻璃纸封口，颠倒混匀10min；

2、待红细胞全部破坏后，打开封口，以2000g离心5min，离心后分三层，取下层红色层液体（放散液）转移到另一试管中； 3、37℃温育30min；

4、取两只试管，标记为待测标本管，阴性对照管，各加入放散液，待测标本管加入待检标本红细胞1滴，阴性对照管加入谱红细胞； 5、混匀，放于37℃温育1h；

6、洗涤红细胞 取出，用生理盐水洗涤3~4次。最后一次洗涤后，倒掉 全部的盐水，加抗球蛋白试剂2滴，充分混匀，以1000r/min离心1min。 7、观察结果

8、报告方式 红细胞抗体释放试验阳性或阴性。