9．答：

(1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主

传递，也不希望被带动转移。

(2)具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307(ColEl的衍生质粒)在哺乳动物正常体温

下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。 (4)有较小的宿主范围。 10． 答：

(1)菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能大于

基因组的105％，所以要将?噬菌体改造成载体，必须削减分子量。

(2)野生型的?DNA对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。 (3)没有可供选择的标记。

(4)野生型的?噬菌体具有感染性，因此不够安全。 11．答：

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在?载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌?—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的?载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—?—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—?—D—半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 12．答：

?—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，，可以进行修饰，并不影响酶的活性或?肽的互 补性。如果插入的外源DNA引起?肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。 13．答

M13克隆系统具有很多优点：

(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大，有

报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6—7倍的DNA(插人片段可达40kb)。

(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链DNA探针都

是十分有用的。

(3)单链DNA和双链DNA都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。 M13克隆系列的不足：

(1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定，一般说，克隆的片段越大，发

生丢失的机率越大。

(2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。 14．答：

主要特点有：

(1)具有质粒复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。 (2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。 (3)具有?噬菌体的包装和转导特性。

(4)容载能力大。克隆的最大片段在45kb，最小片段为19kb。

(5)简化了筛选。如果载体的分子量在5kb的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可

能性，因为要被成功包装，至少要7个分子的载体自连，尽管如此，也是不能被包装的，因为COS位点太多了。

黏粒载体也有如下不足：(1)如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使

被克隆的片段重排或丢失。

(2)含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同，会造成同一个子板上菌落大小不一。另

外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。 (3)包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。 15．答：

虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。 辅助噬菌体必需具备如下条件：

(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗

粒中；

（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功

能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；

(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。 16．答：

可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者

利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。 17．答：

基因文库，或克隆文库，是一群细菌克隆，每个克隆含有一个带有某一供体生物不同DNA片段的质粒或噬菌体载体；这群克隆有95％-99％的可能性使基因组DNA的每一片段至少存在于一个克隆中。一个基因文库一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所携带的基因，因而在需要克隆某一特定基因时就避免了逐个巡查克隆的耗时过程。为减少所要收集的克隆的数目，最普遍采用的载体是?噬菌体的一种衍生载体，它可容纳12~20kb的供体DNA片段，这点与pBR322不同，它可插入的外源DNA最大约为5kb． 18．答：

基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。 19．答：

同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA, 即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到韵cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。 由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性．有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某—生物全部编码基因。 cDNA文库与基因组文库的主要差别是：

(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具

有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；

(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编

码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响；

(3)基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而eDNA克隆的是不含

内含子的基因。 20．答：

黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；

(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。 21．答：

所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。 同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：．(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。 22．答：

将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源DNA的分子上，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。 23．答：

同裂酶是一类识别序列不完全相同，但是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性

内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理载体和外源DNA得到的末端可以通过黏性末端连接法连接。

同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时，在限制性内切核酸酶切割反应之后不必将原有的内切酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在，就不会发生载体自连，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。 反应中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶，其中两种是识别六碱基的酶，另一种是识别四碱基的酶。 24．答：

由于基因已被测序并进行了分析，因此前体mRNA结构是已知的。这对了解蛋白质的功能区是十分重要的，可以避免有关多肽翻译后加工的一些问题。对于间断基因，cDNA可以用外显子DNA探针通过体外杂交得以鉴定。将拟南芥的基因组DNA或cDNA分别克隆到酵母人工染色体(YAC)上作为定位或筛选的融合标签，基因可以在酵母中作为细胞质蛋白质或分泌蛋白质进行表达。 25．答：

(1)加四环素；(2)Tetr Kans和Tetr Kanr；(3)重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，

选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所需的重组体。 26．答： 原理：

由于四环素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成，而不是杀死细菌；而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺人蛋白质，则是致命的。因此在有四环素的条件下，环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌。经过环丝氨酸处理后，存活的细胞中tets型得到很大富集，而经过若干次连续处理，即能获得在tetr基因内含有插人物的质粒的细胞。 基本操作：

(1)转化后有三种表型的细菌，其中只有一种是重组体：AprTcs； (2)用重组DNA转化受体菌后，将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养；

此时只有非重组的双抗性菌可以生长，其他都被抑制；

(3)由于有环丝氨酸的存在，AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡；

(4)由于四环素只有抑菌而无杀菌作用，此时若解除四环素(离心洗涤)，加入氨基苄青霉

素继续培养，则可使重组体大量生长。 27．答：

这一方法的基本原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是：

(1)抗体分子可以牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯塑料)上而不被洗脱掉； (2)一个抗原可以同几种不同的抗体结合； (3)抗体分子可以通过碘化作用被125I标记。 28．答：

随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序(46=4096)；或是用DNA酶处理小牛胸腺DNA后获得的6—12个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底物中有放射性的dNTP时，新合成的DNA就带上了标记。 29．答：

通过一定的物理学方法将DNA或RNA从凝胶上转移到固体支持物，然后同液体中的探针进行杂交。DNA或RNA从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故此将这种杂交称为印迹杂交。 30．答：

根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上，然后用放射性标记的探针同固定了的DNA进行杂交经放射自显影后，确定哪一个菌落含有重组的DNA分子，再从参比平板上选取重组体。 31．答：

1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相—液相杂交。该法的主要特点是利用毛细现象将DNA转移到固体支持物上，称为Southern转移或Southern印迹 (Southern blotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。 32．答：

Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同：

(1)转移的对象不同，Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持

物上的过程。

(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，

它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA的降解。

33．答：带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主细胞表型

的可见变化。然而，真核生物的基因不都表达，则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用方法是杂交(图A21．1)：

(1)从不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH使之变性(图

A21．1.1)。

(2)探针必须能与所需的基因互补且被32p标记。探针可以是来自另一不同生物体的相关

的基因，或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计并经化学合成的一小段DNA分子(图A21．1．2)。

(3)探针只会与特定基因进行碱基配对(杂交)，冲洗滤膜后，未结合上的标记探针会被除

去(图A21．1.3)。

(4)烘干滤膜后进行放射自显影后，所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来，这就是

菌落或原位杂交分析。